Kultivieren Sie Escherichia coli zunächst in 5 Millilitern Luria-Bertani- oder LB-Medium in einem sterilen Polystyrol- oder Glaskulturröhrchen. Inkubieren Sie das Röhrchen über Nacht bei 37 Grad Celsius und schütteln Sie es bei 200 U/min. Subkultur die über Nacht gewachsene Kultur 1 bis 50 in 100 Milliliter LB in einem Erlenmeyerkolben.
Inkubieren Sie die Kultur bei 37 Grad Celsius und 200 U/min für ca. 1,5 Stunden. Als nächstes geben Sie 100 Mikroliter des T4-Phagenbestands mit hohem Titer in die E.coli-Kultur und inkubieren bei 37 Grad Celsius unter dreistündigem Schütteln. Sobald das T4-Phagenlysat klar ist, sammeln Sie sie in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen.
Zentrifugieren Sie die Lysate 20 Minuten lang bei 4.000 g, um verbleibende Bakterien und Zelltrümmer zu pelletieren. Filtern Sie den resultierenden Überstand mit einem 0,22-Mikron-Nylonfilter und sammeln Sie das Filtrat in einem neuen 50-Milliliter-Röhrchen. Fügen Sie dem gefilterten T4-Phagenlysat 0,1 Volumen Chloroform hinzu, um die verbleibenden Bakterien abzutöten und das Bakterienwachstum zu verhindern.
Kurz vortexen und das Lysat zehn Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Zentrifugieren Sie das Lysat fünf Minuten lang bei 4.000 g, um das Chloroform vom Lysat zu trennen. Übertragen Sie die oberste Lysatschicht vorsichtig mit einer serologischen Pipette in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen.
Geben Sie 13 Milliliter Phagenlysat in das obere Reservoir der 100-Kilodalton-Zentrifugalfiltervorrichtung. Konzentrieren Sie das Lysat fünf Minuten lang auf 4.000 g oder bis der größte Teil des Lysats den Filter passiert hat. Pipettieren Sie mit einer P200- oder P1000-Pipette die verbleibenden 2 Milliliter Lysat im oberen Reservoir vorsichtig auf und ab, um die Filtermembran zu verstopfen.
Entsorgen Sie das Filtrat aus dem unteren Reservoir in einen Abfallbehälter. Wiederholen Sie die Konzentration und halten Sie etwa 2 Milliliter konzentrierten Phagen im oberen Reservoir zurück. Pipettieren Sie nach dem letzten Schleudern das restliche Lysat vorsichtig im oberen Reservoir auf und ab.
Um das Phagenlysat zu waschen, geben Sie 12 Milliliter salzhaltiges Magnesium oder SM-Puffer in das obere Reservoir und zentrifugieren Sie es 10 Minuten lang bei 4.000 g. Nach dem zweiten Waschen die restlichen 2 Milliliter Lysat im SM-Puffer auf ein Endvolumen von 10 Millilitern resuspendieren. Übertragen Sie das Lysat in ein 50-Milliliter-Röhrchen und lagern Sie es bei 4 Grad Celsius.
Um kontaminierende Endotoxine zu entfernen, fügen Sie 0,4 Volumen 1-Octanol zum Gesamtvolumen des Lysats hinzu. Verschließen Sie den Deckel des Röhrchens mit Siegelfolie und schütteln Sie ihn eine Stunde lang bei 120 U/min, gefolgt von einer Inkubation bei 4 Grad Celsius für 1,5 Stunden ohne Schütteln. Zentrifugieren Sie, um das Endotoxin-Cleared-Lysat vom 1-Octanol zu trennen.
Entfernen Sie vorsichtig so viel 1-Octanol wie möglich mit einer P1000-Pipette und entsorgen Sie es in den entsprechenden Abfallbehälter. Sammeln Sie das Phagenlysat mit einer 18-Gauge-Nadel und einer 10-Milliliter-Spritze unter der verbleibenden 1-Octanol-Schicht. 1 Milliliter Aliquots T4-Phagenlysat in sterile 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen.
Vakuumieren Sie die Röhrchen mit geöffneten Deckeln bei 4.000 g, um restliches 1-Octanol aus dem Lysat zu verdampfen. Bereiten Sie eine serielle Verdünnung von Phagenlysat in Faktor 10 vor, geben Sie dann 5 Mikroliter jeder Verdünnung auf die LB-Agarplatten und inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius. Zählen Sie am nächsten Tag die Plaques, um die plaquebildenden Einheiten oder PFU zu berechnen.
Verdünnen Sie das resultierende Lysat und den SM-Puffer auf die gewünschte Konzentration und retiter zur Bestätigung. Lagern Sie das konzentrierte Lysat bis zur Verwendung bei 4 Grad Celsius.
