Geben Sie zunächst rohe 264,7-Zellen in eine 100-Millimeter-Kulturschale und inkubieren Sie sie mit sechs Millilitern DMEM bei 37 Grad Celsius mit 95 % Luftfeuchtigkeit und 5 % Kohlendioxid. Sobald die Zellen eine Konfluenz von 80 % erreicht haben, aspirieren Sie das alte Medium und waschen Sie die Zellen zweimal mit zwei Millilitern PBS, die auf Raumtemperatur erwärmt wurden. Geben Sie als Nächstes zwei Milliliter PBS in jede Schale, die Zellen enthält, und mischen Sie sie.
Sammeln Sie die Zellen in zwei 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie sie dann drei Minuten lang bei 377 g bei Raumtemperatur. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, resuspendieren Sie die Zellen in zwei Millilitern PBS. Frieren Sie nun die Mikrozentrifugenröhrchen in flüssigem Stickstoff ein, bis sich ein weißer Feststoff bildet, und tauen Sie sie sofort in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad auf.
Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 12.000 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Nehmen Sie als Nächstes zwei Mikrozentrifugenröhrchen, eines mit 100 mikromolaren Xanthatin und eines mit einem gleichen Volumen Dimethylsulfoxid. Geben Sie 450 Mikroliter des zentrifugierten Überstands in jedes Röhrchen und inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.
Übertragen Sie dann 60 Mikroliter Überstand aus jedem Mikrozentrifugenröhrchen auf 14 PCR-Röhrchen. Erhitzen Sie die Röhrchen gleichzeitig drei Minuten lang bei unterschiedlichen Temperaturen mit zwei PCR-Röhrchen bei jeder Temperatur. Legen Sie dann die Röhrchen in die Zentrifuge.
Nehmen Sie nun 48 Mikroliter Überstand aus jedem Röhrchen und geben Sie es in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie 12 Mikroliter SDS-PAGE-Proteinladepuffer in jedes Röhrchen. Erhitzen Sie die verwirbelten Proben in einem Wasserbad bei 100 Grad Celsius für fünf Minuten.
