Bereiten Sie zunächst das SDS-PAGE-Gel vor. Schleudern Sie den aufgetauten Marker und die vorbereiteten zellulären Thermoshift-Assay-Proben. Geben Sie 2,5 Mikroliter Marker in die erste Vertiefung und 20 Mikroliter Proben in jede der verbleibenden Vertiefungen.
Lassen Sie das Gel dann mit 80 Volt laufen. Geben Sie dann 850 Milliliter Reinstwasser, 100 Milliliter wasserfreies Ethanol und 50 Milliliter Schnelltransferpuffer in ein Becherglas und rühren Sie gut um. Schneiden Sie die Polyvinylidenfluorid- oder PVDF-Membran entsprechend der Größe des Gels zu und markieren Sie sie.
Weichen Sie es dann 30 Sekunden lang in Methanol ein, um es zu aktivieren. Legen Sie die Transferklammern, das Schwammpad und drei Lagen Transferfilterpapier in ein Fach mit dem Transferpuffer. Sobald die Elektrophorese abgeschlossen ist, gießen Sie die Elektrophoreselösung aus dem Elektrophoresegerät aus und entfernen Sie die Platte.
Entfernen Sie das Gel vorsichtig mit einem Plastikmesser und schneiden Sie es so, dass der Proteinmarker und die Zielproteine deutlich sichtbar sind. Nachdem Sie das Gel in der Transmembranlösung gewaschen haben, legen Sie es flach auf das Filterpapier. Tauchen Sie die aktivierte PVDF-Membran in die Transferlösung.
Halten Sie die beschriftete Seite mit einer Pinzette fest und decken Sie das Gel mit der Vorderseite nach unten ab. Legen Sie dann die zusammengebaute Transfereinrichtung in den Transfertank. Geben Sie die restliche Transmembranlösung in die Transmembrankassette.
Stellen Sie die aktuelle Uhrzeit und die Uhrzeit ein und drücken Sie Run, um die Übertragung bei Raumtemperatur zu starten. Geben Sie nun sechs Milliliter 5%ige BSA-Lösung mit TBST in die Inkubationsbox. Sobald der Transfer abgeschlossen ist, nehmen Sie die PVDF-Membran aus dem Setup, während Sie die Markierungsseite einklemmen, und legen Sie sie in die Inkubationsbox.
Nachdem Sie die BSA-Lösung aus der Inkubatorbox genommen haben, fügen Sie sechs Milliliter Primärantikörper hinzu. Stellen Sie die Inkubationsbox über Nacht unter Schütteln in eine Schaumstoffbox mit Eisbeuteln. Sammeln Sie am nächsten Tag den Primärantikörper in einem Röhrchen und waschen Sie die Membran mit sechs Millilitern TBST-Lösung.
Geben Sie anschließend sechs Milliliter Sekundärantikörper in die Inkubationsbox. Am Ende der Inkubation sammeln Sie den sekundären Antikörper und waschen Sie die Membran fünfmal mit TBST, wie oben gezeigt. Mischen Sie gleiche Volumineszenz-Reagenzien A und B.Öffnen Sie das Gel-Imaging-System.
Klicken Sie auf Proben, überprüfen Sie die Kalibrierung und warten Sie, bis die Kalibrierung abgeschlossen ist. Klicken Sie dann auf die Markierung und überprüfen Sie die Kalibrierung. Nehmen Sie nun die Markierungsseite des Streifens mit einer Pinzette auf und tauchen Sie sie vollständig in die chemilumineszierende Reagenzlösung ein.
Klemmen Sie eine Seite des Markers fest, um den Streifen mit der bedruckten Seite nach unten in den Imager zu legen, und schließen Sie den Deckel des Imagers. Stellen Sie die Belichtungszeit auf eine Sekunde ein und klicken Sie auf Aufnehmen. Klicken Sie auf Speichern.
Benennen Sie das Bild und speichern Sie es als TIFF-Datei. Der zelluläre Thermoshift-Assay zeigte, dass Xanthatin die thermische Stabilität des Keap1-Proteins im Temperaturbereich von 48 bis 57 Grad Celsius im Vergleich zur Dimethylsulfoxidgruppe bemerkenswert verschiebt.
