Verwenden Sie zunächst einen Diamantstift, um einen Standard-Glasdeckzettel in drei gleiche Streifen zu teilen. Verwenden Sie Vakuumfett, um ein Stück des Deckstreifens auf den Boden eines selbstgebauten Kammerhalters zu kleben. Befestigen Sie in ähnlicher Weise das zweite Stück des Abdeckstreifens an der Oberseite des Kammerhalters.
Als nächstes injizieren Sie mit einer Pipettenpistole 200 Mikroliter der markierten RBC-Suspension zwischen die beiden Deckgläser. Um die Mikropipetten-Aspiration zusammenzubauen, montieren Sie die Zellkammer auf dem Haltertisch auf einer Mikroskopplattform. Stellen Sie die Position der Kammer so ein, dass sie sich direkt unter dem Objektiv befindet.
Senken Sie nun die Halterung ab, bis sie unter dem Flüssigkeitsstand des angeschlossenen Wasserbehälters liegt. Injizieren Sie demineralisiertes Wasser in die Mikropipette und verwenden Sie dann eine Spritze mit einer 34-Gauge-Nadel, um Luftblasen zu entfernen. Schrauben Sie das Ende des Mikropipettenhalters halb ab und lassen Sie das Wasser einige Sekunden lang aus dem Halter tropfen.
Führen Sie anschließend die mit Suspension gefüllte Mikropipette in die Halterspitze ein und ziehen Sie die Halterschraube fest. Legen Sie die Mikropipette in die Zellkammer. Suchen Sie dann die Pipette und die Erythrozyten unter dem Mikroskop.
Senken Sie die Pipettenspitze ab, um sicherzustellen, dass sie mit den befindlichen RBC nivelliert ist. Stellen Sie die Höhe des Wasserbehälters ein, um den Hydraulikdruck an der Spitze auf Null zu setzen. Heben Sie dann den Wasserbehälter leicht an, um einen subtilen Überdruck zu erzeugen.
Schalten Sie die 488-Nanometer-Leuchtstoffröhren-Anregungslichtquelle ein. Schalten Sie die Leuchtstofflampe und die übertragene Kamera ein. Geben Sie die Belichtungszeit, den interessierenden Bereich und die Binning-Größe für beide Kameras in die entsprechende Software ein.
Stellen Sie dann die Erfassungsnummer im Bereich Mehrdimensionale Erfassung auf 2000 ein. Wählen Sie das gewünschte Speicherverzeichnis. Suchen Sie als Nächstes die Mikropipette mit Hilfe des Mikromanipulators.
Schalten Sie die pneumatische Druckklemme ein und stellen Sie sicher, dass sich der Schaltkasten im externen Modus befindet. Drehen Sie den Knopf langsam, um den Offsetdruck im System auszugleichen. Starten Sie die Software, die die pneumatische Klemme steuert.
Verwenden Sie das elektrische Bedienfeld, um den Druck mit einem Quecksilberumrechnungsfaktor von 20 Millivolt pro Millimeter zu kontrollieren. Stellen Sie nun den Druck im System auf Null und platzieren Sie die Mikropipette vorsichtig in der Nähe der Erythrozyten. Passen Sie die Position des Wasserbehälters an, um einen subtilen Überdruck an der Spitze der Mikropipette zu erzeugen.
Starten Sie die Erfassung in der Kamerasoftware und schalten Sie den Fluoreszenzverschluss ein. Geben Sie die berechnete Spannungsgröße in das Bedienfeld ein, um den gewünschten Druck zu erreichen und eine RBC anzusaugen. Halten Sie den Druck für einen voreingestellten Zeitraum und lassen Sie ihn dann los.
Wiederholen Sie das Experiment auf ähnliche Weise mit dem nächsten RBC, bevor Sie weitere Analysen durchführen. Ein inkrementeller Druckanstieg führte zu einer erhöhten Mobilisierung von Kalziumionen in die Erythrozyten.
