Beginnen Sie mit dem Herunterladen der ungeschärften Halbkarten der Apo-Enolase aus zusätzlichen Daten in EMDB. Öffnen Sie dann ChimeraX und klicken Sie in der Symbolleiste auf Öffnen. Wählen Sie die halben Karten der Apo-Enolase aus.
Geben Sie dies in die Befehlszeile ein, um die halben Maps zu kombinieren und die unscharfe Apo-Enolase-Map zu erhalten. Stellen Sie den Schwellenwert der Karte auf 0,0595 ein, um das Rauschen zu reduzieren. Geben Sie dann diesen Befehl ein, um die kombinierte Karte umzubenennen.
Klicken Sie auf Öffnen. Wählen Sie die PEP enolase unscharfen Halbzuordnungen aus und geben Sie diesen Befehl in die Befehlszeile ein. Passen Sie den Schwellenwert des Maps auf 0,0721 an, um das Rauschen zu reduzieren, und benennen Sie das Map um.
Zeigen Sie dann die ungeschärften Apo-Enolase- und PEP-Enolase-Maps an und klicken Sie im Map-Panel auf Anpassen, um eine Differenzkarte zu berechnen. Geben Sie diesen Befehl in die Befehlszeile ein, um die PEP-Enolase-Map von der Apo-Enolase-Map zu subtrahieren und den Schwellenwert anzupassen. Färbe die subtrahierte Karte grün ein, was eine positive Dichte angibt.
Öffnen Sie als Nächstes PDB und laden Sie die Koordinaten von mycobacterium tuberculosis octameric enolase herunter. Klicken Sie dann in ChimeraX in der Symbolleiste auf Öffnen und wählen Sie den Dateinamen aus. Klicken Sie auf Molekülanzeige, Atome ausblenden und Cartoon anzeigen.
Geben Sie diesen Befehl ein, um das Modell umzubenennen. Wählen Sie das Modell in der Gruppe Modell aus. Klicken Sie mit der rechten Maustaste in der Symbolleiste.
Klicken Sie dann auf Modell verschieben, und positionieren Sie das Modell in der Nähe der PEP-Enolase-Map. Richten Sie das Modell in Bezug auf die Karte aus. Passen Sie dieses Modell in die unscharfe PEP-Enolase-Karte ein, indem Sie diesen Befehl in die Befehlszeile eingeben.
Überprüfen Sie die Passform. Passen Sie die Farb- und Strukturdarstellung an. Öffnen Sie Coot über das Terminal, indem Sie coot&Click on File (Datei) eingeben, dann Open Coordinates (Koordinaten öffnen) und Apo-enolase.pdb auswählen.
Laden Sie als Nächstes die PEP-gebundene Enolase-Sharpened-Map von EMDB herunter. Zeigen Sie diese Karte in Coot an, indem Sie auf Datei und Karte öffnen klicken. Scrollen Sie mit der mittleren Maustaste, um den Schwellenwert auf 7,00 Sigma einzustellen.
Klicken Sie auf Validieren und dann auf Nicht modellierte Blobs. Geben Sie im neuen Fenster 7.00 als RMSD ein, und klicken Sie auf Blobs suchen. Lokalisieren Sie die nicht modellierte Ligandendichte in der Nähe der Reste des aktiven Zentrums, Serin 42, Lysin 386 und Arginin 364.
Klicken Sie anschließend auf Datei, Monomer abrufen und geben Sie PEP ein, um die PEP-Monomer-Modelldatei aus der Coot Monomer-Bibliothek zu erhalten. Verschieben Sie das PEP-Molekül auf die Dichte, indem Sie die Option "Zonenkettenmolekül drehen" im Seitenleistenmenü verwenden. Klicken Sie dann in der Seitenleiste auf Real Space Refined Zone, um das PEP-Molekül in die Dichte einzupassen.
Bewerten Sie die Passform und klicken Sie auf Akzeptieren, wenn Sie fertig sind. Verwenden Sie die Option Merge Molecule auf der Registerkarte Bearbeiten, um den angepassten Liganden mit dem Apo-Enolase-Modell zusammenzuführen und das Modell als PEP enolase.pdb zu speichern. Klicken Sie dann auf Berechnen, NCS-Werkzeuge, gefolgt von NCS-Liganden, um Liganden zu den restlichen Monomeren in der Koordinatendatei hinzuzufügen.
Wählen Sie für das Protein mit NCS-Option die Koordinatendatei Apo-Enolase. pdb und Ketten-ID A als NCS-Master-Kette. Wählen Sie als Nächstes für das Molekül, das den Liganden enthält, Apo-Enolase.
pdb als Koordinatendatei, die Ketten-ID J und die Restnummer 121. Klicken Sie auf Kandidatenstellen suchen. Klicken Sie auf die einzelnen Kandidatenliganden und analysieren Sie die Passung visuell.
Modellieren Sie dann zwei Magnesiumionen in der Dichte des aktiven Zentrums, indem Sie am Zeiger auf Atom platzieren klicken und MG aus der Liste Zeigeratomtyp auswählen. Fügen Sie außerdem die Magnesiumionen in die symmetriebezogenen Monomere ein. Beurteilen Sie die Passung für die symmetriebezogenen Magnesiumatome.
Speichern Sie das Modell, indem Sie auf Datei und dann auf Koordinaten speichern klicken. Wählen Sie den Dateinamen aus und geben Sie enolase plus PEP plus MG.pdb ein. Öffnen Sie dann die Phoenix-GUI.
Führen Sie einen realen Speicherverfeinerungsauftrag mit Standardparametern mit dem gespeicherten Modell und der PEP-gebundenen geschärften Karte aus. Um den modellierten Liganden zu visualisieren, öffnen Sie PyMOL, klicken Sie auf Datei und dann auf Öffnen, um das verfeinerte Modell aus dem Phoenix-Verfeinerungsauftrag zu laden. Laden Sie auch die PEP-gebundene Sharpened Map.
Benennen Sie die Map in PEP sharpened um, indem Sie auf Aktionen und dann auf Umbenennen klicken. Wählen Sie dann die Liganden aus, indem Sie auf Anzeige und dann auf Sequenz klicken. Geben Sie diese in die Befehlszeile ein und drücken Sie die Eingabetaste.
Dadurch wird die Map-Dichte um die Auswahl herum geschnitzt. Klicken Sie auf das letzte Feld C, neben dem mesh_ligand Objekt, um die Farbe des Ligandennetzes in Blau zu ändern. Zeigen Sie die Reste des aktiven Zentrums an, die mit den PEP- und Magnesiumionen in der Stick- und Kugeldarstellung und dem Enolase-Enzym in der Cartoon-Darstellung interagieren.
Legen Sie die Maschenweite fest. Geben Sie diese in die Befehlszeile ein, um Raytracing durchzuführen und das Bild als PNG-Datei zu speichern. Während der Glykolyse wandelt Enolase zwei Phosphoglycerat in Phosphoenolpyruvat um, ein wichtiges Zwischenprodukt für verschiedene Stoffwechselwege.
Die Differenzkarte des Apo-Enzyms und des PEP-gebundenen Enzyms zeigte eine deutliche Ligandendichte. Außerdem wurde eine zusätzliche Dichte im aktiven Zentrum des modellierten Proteins beobachtet. Phosphoenolpyruvat und zwei Magnesiumionen wurden in der Dichte modelliert, die in der Nähe des Liganden beobachtet wurde.
Phosphoenolpyruvat bildete Wasserstoffbrückenbindungen mit mehreren Resten des aktiven Zentrums, wie Lysin 386 und Arginin 364. Die Magnesiumionen bildeten metallische Koordinationsbindungen mit Aspartat 241, Glutamat 283, Aspartat 310 und dem Phosphat von Phosphoenolpyruvat.
