Bereiten Sie zunächst 10 Milliliter 2X AlkB-Reaktionspuffer vor und sterilisieren Sie ihn durch einen 0,2-Mikron-Spritzenfilter. Geben Sie in ein steriles PCR-Röhrchen 20 Mikroliter der Linker-1-ligierten RNAs, 50 Mikroliter des 2X-AlkB-Reaktionspuffers, zwei Mikroliter der AlkB-Demethylase, einen Mikroliter RNA-Inhibitor und 27 Mikroliter RNAs mit freiem Wasser, um die AlkB-Verdauungsreaktion vorzubereiten. Inkubieren Sie das AlkB-Verdauungsgemisch zwei Stunden lang bei Raumtemperatur, um die posttranskriptionelle Methylierung von den RNAs zu entfernen.
Für eine saubere Phasentrennung geben Sie 50 Mikroliter RNAs-freies Wasser in die AlkB-Reaktion. Fügen Sie dann 100 Mikroliter Phenol-, Chloroform- und Isoamylalkoholmischung hinzu. Schütteln Sie die Tube 10 Sekunden lang.
Das AlkB-Gemisch bei 16.000 g 10 Minuten lang zentrifugieren. Übertragen Sie etwa 140 Mikroliter der oberen wässrigen Schicht, die RNAs enthält, in ein steriles 1,5-Milliliter-Röhrchen. Um restliches Phenol zu entfernen, fügen Sie den extrahierten RNAs 100 Mikroliter Chloroform hinzu und schütteln Sie das Röhrchen.
Zentrifugieren Sie die Mischung 10 Minuten lang bei 16.000 g und überführen Sie etwa 120 Mikroliter der oberen wässrigen Schicht in ein steriles 1,5-Milliliter-Röhrchen. Nach der reversen Transkriptionsreaktion fügen Sie einen Mikroliter fünfmolares Natriumhydroxid in den RNA-cDNA-Hybrid hinzu. Inkubieren Sie drei Minuten lang bei 93 Grad Celsius, um den RNA-Strang des RNA-cDNA-Hybrids zu hydrolysieren.
Fügen Sie dann 0,77 Mikroliter fünfmolare Salzsäure hinzu, um die Reaktion zu neutralisieren. Bereiten Sie ein 3%iges Agarose-Gel in TAE-Puffer vor. Mischen Sie einen Mikroliter 6X Ladefarbstoff in fünf Mikroliter PCR-Produkt und laden Sie das Gel mit der Mischung.
Laden Sie fünf Mikroliter mit 50 oder 100 Basenpaar-DNA-Leitern in die Vertiefung vor der ersten Probe und in die Vertiefung nach der letzten Probe. Führen Sie die Gelelektrophorese bei 120 Volt und 400 Milliampere für 75 Minuten durch, um die PCR-Produkte zu lokalisieren. Legen Sie das Gel nach der Elektrophorese in eine Schachtel und füllen Sie sie mit deionisiertem Wasser, bis das Gel vollständig eingetaucht ist.
Geben Sie 10 Mikroliter Ethidiumbromid in das Wasser. Wickeln Sie die Schachtel mit Folie ein und färben Sie sie 30 Minuten lang auf einem Shaker. Entsorgen Sie das mit Ethidiumbromid enthaltende Wasser in eine Abfallflasche, die in einem Abzug platziert ist.
Spülen Sie das Gel einmal mit entionisiertem Wasser ab und entsorgen Sie das Wasser in eine Abfallflasche. Nachdem Sie das Gel 10 Minuten lang mit deionisiertem Wasser gewaschen haben, verwenden Sie einen Gel-Imager, um die Banden zu visualisieren und ein hochauflösendes Bild des Gels aufzunehmen.
