Analyse der mitochondrialen Funktion in Ethidiumbromid-induzierten kleinen Kolonien von Candida glabrata

Um mit der Kultivierung von Candida glabrata zu beginnen, ordnen Sie alle experimentellen Materialien auf der Arbeitsplattform an. Wählen Sie eine einzelne Kolonie von C.glabrata aus einer Hefe-Pepton-, Dextrose- oder YPD-Agar-Platte. Und geben Sie es in ein Reagenzglas aus Glas, das 3 Milliliter YPD-Medium enthält.

Inkubieren Sie 14 bis 16 Stunden bei 25 Grad Celsius und schütteln Sie bei 155 U/min. Nach der Inkubation verdünnen Sie die Kultur in frischem YPD, um eine optische Dichte von 600 Nanometern von 0,1 zu erhalten. Inkubieren Sie die verdünnte Kultur sechs Stunden lang bei 25 Grad Celsius und schütteln Sie sie bei 155 U/min.

Bereiten Sie eine Hefesuspension mit einer optischen Dichte bei 600 Nanometern von 0,1 in YPD bis 3 Milliliter vor. Fügen Sie 30 Mikroliter Ethidiumbromid-Brühe hinzu und inkubieren Sie die Hefesuspension über Nacht bei 25 Grad Celsius bei 155 U/min in einem 45-Grad-Winkel. Stellen Sie am nächsten Tag die optische Dichte der Kultur mit frischem YPD-Medium auf 0,65 ein.

In einer 96-Well-Platte werden 20 Mikroliter der Hefesuspension zu 180 Mikrolitern PBS pro Well gegeben, um eine zehnfache Verdünnung zu erzielen. Platte 20 Mikroliter jeder Verdünnung auf vier Quadranten der YPD-Agarplatte. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius.

Am nächsten Tag Quadranten mit fünf bis 80 Kolonien auswählen und 20 Mikroliter 20%iges Triphenyltetrazolium hinzufügen. Und fügen Sie 20 Mikroliter 20%iges Triphenyltetrazoliumchlorid direkt in die Mitte jeder Kolonie hinzu. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für 30 bis 40 Minuten.

Scannen Sie Platten mit 1200 DPI mit einem optischen 48-Bit-Vollfarbscanner. Das DNA-Interkalationsmittel, Ethidiumbromid, induziert effektiv kleine Mutanten von C.glabrata.