Analyse der mitochondrialen Funktion in Fluconazol-induzierten kleinen Kolonien von Candida glabrata

Zu Beginn legen Sie die Candida glabrata Kultur und das YPD-Medium auf eine Arbeitsplattform. Die optische Dichte der Hefezellsuspension bei 600 Nanometern wird mit dem YPD-Medium auf 0,1 eingestellt. Übertragen Sie einen Milliliter der Zellsuspension in ein Fünf-Milliliter-Röhrchen.

Tauchen Sie ein steriles Wattestäbchen in die Hefezellsuspension. Tupfen Sie die Watte auf der Mueller Hinton Agar-Platte hin und her und drehen Sie sie dabei zweimal um 60 Grad. Tupfen Sie dann den Umfang ab, um eine gleichmäßige Abdeckung zu gewährleisten.

Teilen Sie die Platte mit einem Marker in drei gleich große Sektoren. Sterilisieren Sie die Pinzette ein bis zwei Sekunden lang über einer Flamme. Legen Sie nach dem Abkühlen eine leere Scheibe in die Mitte jedes Sektors.

Geben Sie 12,5 Mikroliter Fluconazol-Brühe auf jede Disc. Gründlich mischen, um Blasen zu vermeiden, und 20 bis 24 Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren. Geben Sie am nächsten Tag 20 Mikroliter 20%iges Triphenyltetrazoliumchlorid direkt in die Mitte jeder Kolonie.

Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für 30 bis 40 Minuten. Scannen Sie die Platte mit 1200 DPI mit einem optischen 48-Bit-Vollfarbscanner. Die Behandlung mit Fluconazol induziert effektiv kleine Mutanten von C. glabrata.

Eine klare kreisförmige Zone ohne Wachstum umgab die Fluconazol-Scheibe in der T-Null-Kultur, was auf eine geringere Arzneimittelresistenz beim Elternpilz hinweist. In der T-3-Kultur bildeten sich viele zierliche Kolonien in der Nähe der Bandscheibe, was auf eine Arzneimittelresistenz nach drei wiederholten photodynamischen Therapiebehandlungen hindeutet.