Analyse der mitochondrialen Funktion in antimykotischen, photodynamischen Therapie-induzierten kleinen Kolonien von Candida glabrata

Platzieren Sie zunächst die Candida Glabrata Kultur und das YPD-Medium auf einer Arbeitsplattform. Passen Sie die optische Dichte der Hefezellsuspension bei 600 Nanometern auf 0,65 mit YPD-Medium an. Mischen Sie einen Milliliter Hefesuspension mit 111 Mikrolitern 2%iger Rose Bengal in einem Röhrchen mit rundem Deckel.

Inkubieren Sie die Mischung 15 Minuten lang bei 25 Grad Celsius und drehen Sie sie in einem 45-Grad-Winkel bei 155 U/min. Nach der Inkubation die Mischung in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen umfüllen und bei 16.100 g 2,5 Minuten zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand und kratzen Sie das Rohr fünfmal vorsichtig ab, um das Pellet wieder aufzuwirbeln.

Waschen Sie die Suspension viermal mit PBS, um alle Rose Bengal zu entfernen. Nach dem letzten Waschen werden 200 Mikroliter der mit Rose Bengal beladenen Hefesuspension in jede der drei Vertiefungen in einer 96-Well-Platte überführt. Positionieren Sie die Platte auf dem Photodynamic Light System mit LED-Lampen, die grünes Licht von unten leuchten.

Aktivieren Sie das LED-Lichtsystem, um die photodynamische Therapiedosis von 4,38 Joule pro Quadratzentimeter über zwei Minuten abzugeben. Nach der Bestrahlung 20 Mikroliter Hefesuspension in eine Vertiefung mit 180 Mikrolitern PBS geben, wodurch eine zehnfache Verdünnung entsteht. Für jeden Verdünnungsfaktor ist 20 Mikroliter pro Quadrant auf YPD-Schneckenplatten zu plädieren.

Drehen Sie die Platte um und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 Grad Celsius. Zählen Sie am nächsten Tag die Anzahl der Völker in jedem Quadranten. Berechnen Sie mit der angegebenen Formel die koloniebildenden Einheiten pro Milliliter.

Geben Sie 20 Mikroliter 20%iges Triphenyltetrazoliumchlorid direkt in die Mitte jeder Kolonie und inkubieren Sie 30 bis 40 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Scannen Sie Platten mit 1.200 DPI mit einem optischen 48-Bit-Vollfarbscanner. Nach der Herstellung von TZero Hefesuspension in der verzögerten Wachstumsphase setzen Sie sie 4,38 Joule pro Quadratzentimeter grünem Licht in Gegenwart von 0,2%Rose Bengal aus.

Kennzeichnen Sie die überlebenden Pilze als T-1. Setzen Sie die überlebenden Pilze der gleichen PDT-Dosis aus. Zierliche Mutanten von C-Glabrata zeigten ein langsameres Wachstum im Vergleich zu den unbehandelten Elternpilzen normaler Größe.

Eine einzige antimikrobielle photodynamische Therapie hemmte das Wachstum von C-Glabrata signifikant um drei Verzögerungen im Vergleich zur Kontrolle. C-Glabrata zeigte 24 Stunden nach der Behandlung mit der antimikrobiellen photodynamischen Therapie eine bimodale Koloniegrößenverteilung mit großen und kleinen zierlichen Kolonien. Die zierlichen Kolonien, die eine weiße Farbe beibehielten, wiesen eine mitochondriale Dysfunktion auf, während einige kleinere rot gefärbte Kolonien und normal große Kolonien eine normale mitochondriale Funktion behielten.