Nehmen Sie zunächst 12-Tage-Kulturen von humanen pluripotenten Stammzellen, die einer Neuralleisteninduktion unterzogen wurden. Saugen Sie das Medium C vorsichtig aus den Zellen ab. Fügen Sie 100 Mikroliter PBS pro Quadratzentimeter Well-Oberfläche hinzu, um die Zellen zu waschen, und entfernen Sie dann das PBS.
Geben Sie ein gleiches Volumen der Zellablösungslösung in die Zellen und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang unter einer Kohlendioxid-Supplementierung von 5 % bei 37 Grad Celsius. Geben Sie das gleiche Volumen NCC-Medium in die Platte. Verwenden Sie dann eine serologische Pipette, um die Zellsuspension zu ernten und in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen zu überführen.
Drehen Sie die Zellen zwei Minuten lang bei 290 G zwischen 20 und 25 Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig, ohne das Zellpellet zu stören. Verwenden Sie eine serologische 10-Milliliter-Pipette, um 12 Milliliter NCC-Medium in das Zellpellet zu pipettieren.
Pipettieren Sie die Suspension mechanisch auf und ab, um eine Suspension zu erzeugen. Übertragen Sie dann die Zellsuspension auf eine Platte mit extrem niedrigem Anhaftungsgrad. Schwenken Sie die Zellkulturplatten an Tag 14 vorsichtig, um kleine Sphäroide in der Mitte jeder Vertiefung zu sammeln.
Verwenden Sie eine P1000 Mikropipette, um das verbrauchte Medium langsam aus dem Umfang jeder Vertiefung abzusaugen. Füttern Sie die Zellen wieder mit dem ursprünglichen Volumen des NCC-Mediums. Entfernen Sie am 15. Tag vorsichtig das Medium.
Geben Sie PBS in die Vertiefungen, um die Sphäroide zu waschen. Entfernen Sie dann so viel PBS wie möglich und stellen Sie sicher, dass die Sphäroide nicht gestört werden. Fügen Sie als Nächstes 100 Mikroliter Zellablösungslösung pro Quadratzentimeter Well-Oberfläche hinzu.
Inkubieren Sie die Zellen in der Lösung für 30 Minuten unter 5%igem Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius. Geben Sie mit einer serologischen 10-Milliliter-Pipette das gleiche Volumen ENC-Medium in jede Vertiefung. Pipettieren Sie die Lösung mechanisch, um alle verbleibenden Sphäroide zu brechen.
Anschließend werden die Zellen in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen überführt. Den Überstand nach dem Zentrifugieren wie zuvor verwerfen. Dann resuspendieren Sie die Zellen in 5 bis 10 Millilitern ENC-Medium.
Zählen Sie die Konzentration lebensfähiger Zellen mit Trypanblau und Hämozytometer. Fügen Sie nun genügend Volumen ENC-Medium hinzu, um etwa 300.000 bis 400.000 lebensfähige Zellen pro Quadratzentimeter Oberfläche und eine Dichte von etwa 1 Million Zellen pro Milliliter zu plattieren. Saugen Sie dann die Lösungen aus den Vertiefungen an.
Geben Sie dann die Zellen auf eine Platte mit PO/FN-Laminin-beschichteten Vertiefungen. Füttern Sie die Zellen jeden zweiten Tag mit 200 Mikrolitern ENC-Medium pro Quadratzentimeter Well-Oberfläche bis zum 30. bis 40. Tag. Qualitativ hochwertige frei schwebende Kugeln mit glatten Oberflächen wurden nach Neuralleisteninduktion beobachtet.
Die Sphäroide exprimierten den Neuralleistenmarker SOX10. Neuriten wurden zwischen dem 25. und 30. Tag während der Induktion enterischer Neuronen beobachtet.
