Geben Sie zunächst 150 Mikroliter Tagmentationspuffer in die Probenröhrchen mit den markierten Mausmyoblastenproben. Pipettieren Sie EDTA, SDS und Proteinase K in jedes Röhrchen. Den Inhalt der Röhrchen gut vermischen, und dann die Röhrchen zwei Stunden lang bei 55 Grad Celsius in einer PCR-Maschine inkubieren.
Als nächstes pipettieren Sie jede Probe in 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit 200 Mikrolitern Phenol-Chloroform-Gemisch. Wirbeln Sie den Inhalt der Röhrchen auf, um sie zu mischen. Sobald die Zentrifugation abgeschlossen ist, übertragen Sie die oberste Schicht in ein neues 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.
Geben Sie dann 200 Mikroliter Chloroform in die neuen Röhrchen, bevor Sie erneut vortexen und zentrifugieren. Saugen Sie die oberste Schicht in ein neues Rohr an. Geben Sie nun 550 Mikroliter 100%Ethanol in jedes Probenröhrchen und mischen Sie es gut durch Invertieren.
Legen Sie dann die Röhrchen eine Stunde lang bei minus 80 Grad Celsius, um eine DNA-Ausfällung zu induzieren. Zentrifugieren Sie die Lösung 15 Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit, um ein DNA-Pellet zu erhalten. Nach dem Ausgießen des Überstands das Pellet mit 75 % Ethanol waschen, bevor es erneut fünf Minuten lang zentrifugiert.
Dann resuspendieren Sie das Pellet in 21 Mikrolitern doppelt destilliertem Wasser. Richten Sie die PCR ein, die für die Bibliotheksvorbereitung verwendet werden soll. Verwenden Sie für jede Probe einen anderen N7XX Illumina-Primer und einen universellen N5XX-Primer.
Geben Sie die PCR-Zyklusnummer in das Gerät ein, um die PCR durchzuführen. Nach der Amplifikation werden drei Mikroliter der Bibliotheken auf Agarosegele elektrophorisiert. Die CUT&Tag-Bibliotheken enthielten hauptsächlich markierte Mononukleosomen von etwa 300 Basenpaaren.
qPCR zeigte, dass die H3K4me1-Markierung an den Enhancer-Regionen des MYOD1-Gens stark angereichert war.
