Holen Sie sich zunächst geklärtes Virus aus kultivierten Zellen. Legen Sie die Ultrazentrifugenröhrchen in ein Gestell auf der Ausgangsseite der Mehrkanal-Schlauchpumpe. Geben Sie mit einer serologischen Pipette vorsichtig 10 Milliliter geklärtes Virus in jedes Ultrazentrifugenröhrchen.
Übertragen Sie dann 22 Milliliter der 15%igen Iodixanolfraktion in ein sauberes konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Legen Sie die Kapillaren auf der rechten Seite der Pumpe in den Schlauch und starten Sie die Pumpe. Stoppen Sie die Pumpe.
Wenn die Iodixanolfraktion das Ende der Kapillaren auf der Ausgangsseite der Pumpe erreicht, führen Sie eine Ausgangskapillare in jedes Ultrazentrifugenröhrchen mit geklärtem Virus ein und starten Sie die Pumpe. Stoppen Sie die Pumpe, wenn der letzte der 15%-Fraktion in die Eingangskapillaren aufgenommen werden soll. Als nächstes werden 22 Milliliter der 25%igen Iodixanolfraktion in das konische 15-Milliliter-Röhrchen überführt.
Lassen Sie nach dem Einschalten der Pumpe die gesamte Fraktion in die Eingangskapillaren aufnehmen und stoppen Sie die Pumpe. Fügen Sie bei Bedarf mehr von der 60%-Fraktion hinzu und füllen Sie jedes Röhrchen, bis das Lysat eine Kuppel bildet, aber nicht überläuft. Stoppen Sie die Pumpe und entfernen Sie vorsichtig die Ausgangskapillare.
Verschließen Sie das Ultrazentrifugenröhrchen mit einem Abstandshalter und laden Sie es in einen Typ 70 TI-Rotor. Klemmen Sie das Ultrazentrifugenröhrchen nach dem Zentrifugieren an einen Stützständer. Entfernen Sie mit einem fusselfreien Tuch die Kappe vom Ultrazentrifugenröhrchen.
Befestigen Sie dann eine 20-Gauge-Nadel an einer 5-Milliliter-Spritze und durchdringen Sie die Wand des Ultrazentrifugenröhrchens mit der Nadel etwa 3 Milliliter unterhalb der 40- und 60%igen Iodixanol-Grenzfläche. Saugen Sie die Grenzfläche und einen Teil der 40%-Fraktion langsam an. Halten Sie einen Finger über die offene Oberseite des Ultrazentrifugenröhrchens, ziehen Sie die Spritze heraus und übertragen Sie die aspirierte AAV-Fraktion in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen.
Schließlich verdünnen Sie die aspirierte Virusfraktion in AAV-Lysepuffer um das Zweifache auf ein Volumen von 40 Millilitern. Nach dem Spülen eines Schlauchs werden 20 Milliliter der verdünnten AAV-Fraktion für die zweite Fraktionierungsrunde in ein neues Ultrazentrifugenröhrchen geladen.
