Nach der Inkubation der Erdnusssamen nach der Impfung mit Aspergillus flavus-Sporen verwenden Sie eine Pinzette, um die Samenstücke aus dem Agar zu entfernen. Legen Sie die Samenstücke in beschriftete Sieben-Milliliter-Kügelchenfläschchen mit 13 Zirkonium-Keramikkügelchen. Für die Extraktion von Phytoalexinen und Aflatoxinen geben Sie je nach Samengröße zwei oder vier Milliliter eines Methanol-Wasser-Gemisches in das Bead-Fläschchen und pulverisieren Sie 45 Sekunden lang mit 5,5 Metern pro Sekunde.
Dann zentrifugieren Sie bei 1.860 x g für drei Minuten und sammeln Sie den Überstand in einem frischen Fläschchen. Für die Aflatoxin-Analyse wird mit einem Glasstab, der in einem 90-Grad-Winkel geschnitten ist, eine poröse Polyethylenfritte in eine 1,5-Milliliter-Polypropylensäule eingeführt. Geben Sie mit einem speziell angefertigten Löffel 50 Milligramm Magnesium-Kieselgel in die Säule.
Verschließen Sie die Säule mit einer identischen Fritte und drücken Sie sie mit einem Glasstab nach unten. Geben Sie 0,5 Milliliter Überstand in die speziell verpackte Mini-Säule und lassen Sie den Extrakt durch die Schwerkraft in ein Vier-Milliliter-Glasfläschchen abtropfen. Geben Sie einen Milliliter Methanol-Wasser-Gemisch in die Säule, um Verunreinigungen durch Schwerkraft in dasselbe Fläschchen auszuwaschen.
Nachdem Sie die kombinierten Eluate aus dem Fläschchen verworfen haben, geben Sie 1,2 Milliliter Acetonacetylnitrilwasser und ein 88%iges Ameisensäuregemisch in die Säule, um die Aflatoxinfraktion in ein sauberes Glasfläschchen zu eluieren. Verdampft das Lösungsmittel aus dem Fläschchen in einem Stickstoffstrom in einem Heizblock bei 45 Grad Celsius. Nach dem Verdampfen das Fläschchen verschließen und in zerkleinerten Würfeln eine Minute lang abkühlen lassen.
Legen Sie die maßgefertigten Pasteur-Pipettenfilter in Einweg-Reagenzgläser und legen Sie sie auf Eis, um die Verdunstung bei der Filtration zu minimieren. Lösen Sie den trockenen Rückstand in genau dosierten 0,25 bis 1,0 Milliliter Methanol-Wasser-Gemisch auf. Nach dem Vortexen wird ein Aliquot von 0,2 Millilitern in den Filter überführt.
Verwenden Sie Stickstoffgas, um die Filtration in ein 400-Mikroliter-Autosampler-Fläschchen zu beschleunigen. Stellen Sie das Fläschchen in den UPLC-Autosampler und stellen Sie das Injektionsvolumen auf 0,1 bis 3,0 Mikroliter ein. Für Phytoalexin übertragen Sie 200 Mikroliter Überstand aus dem Sieben-Milliliter-Zentrifugenfläschchen in einen Pasteur-Pipettenfilter.
Setzen Sie nach der Filtration eine passende Kappe mit Polytetrafluorethylen-Septum auf das Fläschchen. Für die Trennung von Aflatoxinen ist ein Gradient aus Wasser, Methanol und Acetylnitril mit bestimmten prozentualen Zusammensetzungen und Laufzeiten zu implementieren. Stellen Sie die Durchflussmenge auf 0,45 Milliliter pro Minute und die Laufzeit auf 9,5 Minuten ein.
Stellen Sie in der Systemsäulenheizung die Säulentemperatur auf 40 Grad Celsius ein. Um Aflatoxine zu quantifizieren, stellen Sie die Anregungs- und Emissionswellenlängen auf 362 bzw. 440 Nanometer ein. Führen Sie dann mit der Kalibrierkurvenmethode und dem UPCL-Softwarehandbuch die Analyse durch, um die Aflatoxinkonzentrationen in den Testproben zu bestimmen.
Für die Trennung von Stilbenoiden wird ein Gradient aus Wasser, Methanol und 88%iger Ameisensäure mit bestimmten prozentualen Bedingungen und Zeitpunkten verwendet. Stellen Sie die Durchflussrate auf 0,5 Milliliter pro Minute und die Laufzeit auf 12 Minuten ein. Bestimmen Sie mit der Kalibrierkurvenmethode die Konzentrationen von Stilbenoiden und vergleichen Sie die Peakbereiche der Testprobe mit reinen, authentischen Standards.
Die UPLC-basierte Aflatoxin-Quantifizierungsmethode ermöglicht eine sensitive Quantifizierung von Aflatoxin B1 mit einem Limit von zwei Pikogramm pro Injektion. Der gereinigte Extrakt aus Samen, die von einer wilden Areca-Art geerntet wurden, zeigte eine eindeutige Quantifizierung von Aflatoxinen. Der Ansatz der Magnesium-Kieselgel-Säule entfernt effektiv Verunreinigungen aus der Aflatoxinfraktion und zeigt im Gegensatz zu früheren Methoden eine hohe Effizienz der Quantifizierung.
Darüber hinaus hilft diese Methode auch bei der Quantifizierung von Erdnuss-Phytoalexinen.
