Nehmen Sie zunächst 293FT-Zellen, die in einer 10-Zentimeter-Schale kultiviert wurden, und aspirieren Sie das Medium. Waschen Sie die Zellen mit fünf Millilitern PBS. Fügen Sie dann einen Milliliter Trypsin-EDTA hinzu und inkubieren Sie es 3-5 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um die Zellen von der Schale zu lösen.
Geben Sie nach der Inkubation neun Milliliter vollständiges DMEM in die Zellen, um das Trypsin zu neutralisieren. Pipettieren Sie wiederholt auf und ab, um eine homogene Einzelzellsuspension zu erzeugen, und übertragen Sie die Zellen in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Sofort 20 Mikroliter Zellen in ein 1,7-Milliliter-Röhrchen umfüllen und mit 20 Mikrolitern Trypanblau-Färbung mischen.
Zählen Sie Zellen entweder mit einem automatisierten Zellzähler oder einem Hämozytometer. Übertragen Sie das entsprechende Volumen der Zellen in ein 50-Milliliter-Röhrchen und verdünnen Sie es in vollständigem DMEM. Geben Sie zwei Milliliter Zellsuspension in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Platte.
Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius und 10 % Kohlendioxid. Vor der Transfektion verdünnen Sie Nanoluciferase CRAF und 1433 Zeta-Halo-Plasmide zusammen mit einem leeren pCDNA3-Vektor in TE-Puffer. Beschriften Sie einen Satz steriler 1,7-Milliliter-Röhrchen.
Geben Sie 100 Mikroliter Transfektionsmedium zusammen mit den Expressionskonstrukten in jedes Röhrchen. Fügen Sie nun zwei Mikroliter Transfektionsreagenz hinzu und vermischen Sie es vorsichtig mit einem Vortexen. Pulsieren Sie die Röhrchen kurz in einer Mikrozentrifuge und inkubieren Sie die Röhrchen dann 15 Minuten lang bei etwa 25 Grad Celsius, damit sich Transfektionskomplexe bilden können.
Fügen Sie anschließend den Zellen tropfenweise Transfektionskomplexe hinzu und inkubieren Sie sie 16-20 Stunden lang bei 37 Grad Celsius, um den Halo und die nanomarkierten Proteine zu exprimieren.
