Beschriften Sie zunächst drei Sätze steriler 1,7-Milliliter-Röhrchen und einen Satz steriler 15-Milliliter-Röhrchen mit konischem Boden. Bereiten Sie eine Schwenkschaufelzentrifuge mit 15-Milliliter-Röhrcheneinsätzen vor und kühlen Sie sie auf vier Grad Celsius ab. Nehmen Sie die Sechs-Well-Zellkulturplatte mit transfizierten 293FT-Zellen.
Saugen Sie das Medium aus den Vertiefungen an. Fügen Sie 250 Mikroliter Trypsin-EDTA hinzu und inkubieren Sie bei 37 Grad, bis sich die Zellen abzulösen beginnen. Geben Sie dann einen Milliliter 10 % FBS-supplementiertes Assay-Medium in jede Vertiefung und pipettieren Sie kräftig, um eine Einzelzellsuspension herzustellen.
Übertragen Sie einen Milliliter der Zellsuspension in vormarkierte 15-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie jeweils einen Milliliter 10 % FBS-supplementiertes Testmedium in jedes dieser Röhrchen und invertieren Sie es fünfmal, um es zu mischen. Übertragen Sie dann sofort 20 Mikroliter Zellsuspension in das erste Röhrchenset.
Zentrifugieren Sie nun die 15-Milliliter-Röhrchen fünf Minuten lang bei 250 g in einer vorgekühlten Zentrifuge. Mischen Sie 20 Mikroliter Trypanblau-Färbemittel mit den Zellen im ersten Set und zählen Sie mit einem Zellzähler oder Hämozytometer. Nachdem Sie die 15-Milliliter-Röhrchen aus der Zentrifuge genommen haben, aspirieren Sie Medien aus den Zellpellets und resuspendieren Sie die Pellets in serumfreien Assay-Medien, um eine Einzelzellsuspension zu erzeugen.
Um Zellen in 384-Well- und Six-Well-Platten zu revidieren, invertieren Sie die 15-Milliliter-Röhrchen mehrmals, um eine homogene Zellsuspension zu erhalten, und überführen Sie 500 Mikroliter in 1,7-Milliliter-Röhrchen im zweiten und dritten Set. 0,5 Mikroliter DMSO zum zweiten Set und 0,5 Mikroliter Halo 618 Ligand zum dritten Röhrchenset hinzufügen und gut mischen. Übertragen Sie das DMSO und die ligandenpositiven Zellsuspensionen in separate Vertiefungen mit Reagenzreservoiren.
Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 40 Mikroliter jeder Suspension auf die 384-Well-Kulturplatte zu übertragen. Übertragen Sie die verbleibenden Zellen für die anschließende Western-Blot-Analyse auf frische Sechs-Well-Kulturplatten und inkubieren Sie sowohl 384-Well- als auch Six-Well-Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Nehmen Sie serumfreie Assay-Medien ein, die auf 37 Grad Celsius vorgewärmt wurden.
Verdünnen Sie das aufgetaute Nanoluziferase-Substrat 1:100 in serumfreiem Assay-Medium und überführen Sie es in ein Reagenzreservoir. Übertragen Sie mit einer Mehrkanalpipette 10 Mikroliter der Substratmischung in jede Vertiefung der 384-Well-Kulturplatte. Drehen Sie die Platte vorsichtig eine Minute lang.
Setzen Sie die 384-Well-Platte in einen Multi-Mode-Plattenleser ein und zeichnen Sie die 460- und 618-Nanometer-Emissionen aus allen Wells mit Zellen auf. Berechnen Sie die rohen BRET-Verhältnisse für fahrzeugpositiv und ligandenpositiv in MilliBRET-Einheiten unter Verwendung der angegebenen Gleichung. Berechnen Sie das korrigierte BRET-Verhältnis, indem Sie das Vehikel-positive BRET-Verhältnis von dem des ligandenpositiven Verhältnisses subtrahieren.
Die Nano-CRAFS259A-Mutante reduziert das BRET-Signal um etwa 45 % und die Nano-CRAFS621A-Mutante um etwa 25 %. Die Doppelmutante eliminiert das BRET-Signal nahezu.
