Präparation von Schnitten des Mausgehirns für die Zeitrafferbildgebung zur Bestimmung der zellulären Dynamik

Zu Beginn besorgen Sie sich die euthanasierte Maus, der die entsprechenden Plasmide verabreicht werden. Für die Zubereitung der Kulturschale geben Sie 1,9 Milliliter Nährmedium in eine Glasschale und setzen Sie vorsichtig einen Zellkultureinsatz darauf auf. Geben Sie dann 500 Mikroliter Nährmedium auf den Filter und legen Sie ihn auf Eis.

Entnehmen Sie die Embryonen und legen Sie sie in eine Petrischale, die eiskaltes PBS enthält. Unter dem Mikroskop werden Embryonen basierend auf der Expression von grün fluoreszierendem Protein oder anderen fluoreszierenden Markern ausgewählt. Nachdem Sie das Gehirn präpariert haben, legen Sie es in geschmolzenes Agarosegel, das in einer Kryoform entnommen wurde, und rollen Sie es mehrmals.

Sobald die Agarose bei Raumtemperatur fest wird, legen Sie sie auf Eis. Schneiden Sie die Gehirne mit einem vibrierenden Mikrotom koronal auf eine Dicke von 350 Mikrometern auf und ordnen Sie sie auf dem Filter an. Entfernen Sie dann 600 Mikroliter Nährmedium sowohl von der Innen- als auch von der Außenseite des Filterbechers.

Geben Sie nach fünf Minuten 100 Mikroliter frisches Kulturmedium in die Innenseite des Zellkultureinsatzes. Für Zeitrafferaufnahmen können Sie Bilder mit etwa 10 Z-Stapeln mit einem 20-fachen Objektiv mit großem Arbeitsabstand aufnehmen. Die Analyse von Zeitrafferbildern des Mausgehirns lieferte die Trajektorien von EGFP-positiven wandernden Zellen und RFP-positiven wandernden Zellen von zwei bis 21 Stunden.