Nehmen Sie zunächst einen Objektträger und fügen Sie zwei dünne Streifen doppelseitiges Klebeband hinzu, um die Bildgebung vorzubereiten. Pipettieren Sie etwa 10 bis 15 Mikroliter Eindeckmedium zwischen die beiden Klebebandstreifen für die Gehirnmontage. Übertragen Sie das Etikett Drosophila-Gehirne auf einen Objektträger mit einer P20-Pipettenspitze, die mit PBS und 0,2 % Triton X-100 vorgespült wurde.
Sobald die Gehirne übertragen sind, richten Sie sie mit einem feinen Pinsel aus und stellen Sie sicher, dass die Antennenlappen nach oben zeigen. Nachdem Sie die Gehirne ausgerichtet haben, decken Sie sie mit einem Glasdeckglas ab. Füllen Sie dann die Seiten des Deckglases mit zusätzlichem Montagemedium aus.
Versiegeln Sie die Ränder des Deckglases mit klarem Nagellack. Nachdem Sie den Objektträger gründlich getrocknet haben, bewahren Sie ihn für die spätere Bildgebung im Kühlschrank auf. Verwenden Sie für die Bildgebung ein konfokales Laserscanning-Mikroskop, das mit einem 63X-Ölimmersionsobjektiv ausgestattet ist.
Verwenden Sie einen Argon-488- und Helium-Neon-543-Laser zur Abbildung der synaptischen Glomeruli und der olfaktorischen sensorischen Neuronen des Antennenlappens. Bestimmen Sie die optische Verstärkung und den Offset für beide Kanäle. Positionieren Sie die Bildgebung in der Mitte des Gehirns und fokussieren Sie sich auf die VM7-Glomeruli.
Lokalisieren Sie ungefähr das Loch in der Mitte des Gehirns. Wählen Sie die Bildauflösung von 1024 x 1024 aus. Erfassen Sie eine gesamte konfokale Z-Stack-Projektion durch den Antennenlappen, um sicherzustellen, dass die vollständige Innervation des Or42a-Neurons der VM7-Glomeruli erfasst wird.
Laden Sie das Bild des Genotyps oder des Zustandsblinden in Fidschi. Um die Laserlinienkanäle zu teilen, gehen Sie zum Bild, klicken Sie auf Farbe und wählen Sie geteilte Kanäle aus. Scrollen Sie im olfaktorischen sensorischen Kanal Or42a durch den Z-Stapel, um zu bestimmen, welche Slices die Innervation des Or42a-Neurons enthalten, und identifizieren Sie den Anfang und das Ende der Fluoreszenz.
Um eine Summenschichtprojektion zu erstellen, die nur Slices mit Or42a-Neuroneninnervation enthält, klicken Sie auf Bild und gehen Sie zu Stapel. Klicken Sie dann auf Z-Projekt, wählen Sie Summensegmente aus und geben Sie den gewünschten Bereich ein. Verwenden Sie das Lasso-Werkzeug in Fidschi, um die Umrisse der Innervation des Or42a-Neurons im VM7-Glomerulus nachzuzeichnen.
Multiplizieren Sie den Umfang des verfolgten Bereichs mit der Anzahl der Z-Stapel-Schichten und der Dicke jeder Schicht, um das VM7-Innervationsvolumen des synaptischen Glomerulus zu berechnen. Nach 24-stündiger Exposition gegenüber einem Kontrollodorierungsmittel bleibt in den VM7-Glomeruli beider Antennenlappen eine dichte Or42a MCD:GFP-Innervation bestehen. Im Gegensatz dazu führt eine 24-stündige Exposition gegenüber einem 25%igen EB-Geruchsstoff zu einer erheblichen Beschneidung und einem Verlust des synaptischen glomerulären Volumens.
Eine Erhöhung der EB-Odorstoffkonzentration führt zu einer zunehmend stärkeren Beschneidung der synaptischen Glomeruli. Repräsentative Quantifizierungen für diesen Bereich der EB-Odorantenkonzentrationen zeigten ähnliche Ergebnisse für die Fluoreszenzintensität und das Innervationsvolumen.
