Wählen Sie zunächst ein Nematodenwachstumsmedium oder eine NGM-Platte, die von ausgehungerten Caenorhabditis elegans-Larven im L1-Stadium besetzt wird. Waschen Sie die Würmer mit einem Milliliter sterilem Wasser vorsichtig von der Platte. Aliquotieren Sie etwa 300 Mikroliter der Wurmpopulation auf NGM-Platten, die mit konzentriertem OP50 besiedelt sind.
Lassen Sie die Platten mit einem Plattentrockner oder einem Bunsenbrenner trocknen und inkubieren Sie dann bei 20 Grad Celsius, bis eine signifikante Population zu trächtigen Erwachsenen wird. Um die Würmer zu sammeln, waschen Sie sie mit bis zu 10 Millilitern sterilem Wasser von der Platte ab und geben Sie eine warme Wassermischung in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Lassen Sie die Würmer durch die Schwerkraft etwa vier Minuten lang am Boden des Röhrchens absetzen.
Saugen Sie den Überstand vorsichtig mit einer kleinen Pipettenspitze ab und entsorgen Sie ihn. Füge dann bis zu 15 Milliliter steriles Wasser hinzu. Entfernen Sie nach der letzten Wäsche den Überstand und fügen Sie fünf Milliliter einer frisch zubereiteten Lösung aus Bleiche und Natriumhydroxid hinzu.
Inkubieren Sie die Würmer fünf Minuten lang bei Raumtemperatur und wirbeln Sie sie jede Minute mindestens 10 Sekunden lang vortexen. Überwachen Sie den Fortschritt mit einem Präpariermikroskop. Sobald alle erwachsenen Tiere aufgebrochen sind oder sich aufgelöst haben, fügen Sie M9-Puffer hinzu, um die Reaktion zu neutralisieren, und bringen Sie das endgültige Volumen auf 15 Milliliter.
Zentrifugieren Sie dann das Röhrchen zwei Minuten lang bei 1.300 g. Waschen Sie die Eier zwei weitere Male mit 13 Millilitern M9-Puffer durch Zentrifugation, gefolgt von einer einmaligen Wäsche mit 15 Millilitern S-Puffer. Dann zentrifugieren Sie die Eier zwei Minuten lang bei 1.300 G.Nach der Zentrifugation aspirieren Sie den Überstand und fügen Sie 10 Milliliter S vollständigen Puffer hinzu. Drehen Sie das Röhrchen über Nacht vorsichtig bei Raumtemperatur mit einem Mutator oder einem ähnlichen Gerät.
Beurteile mit einem Präpariermikroskop, ob die Würmer geschlüpft sind. Zählen Sie die Würmer in 10-Mikroliter-Tropfen S-Puffer unter dem Mikroskop. Bereiten Sie eine Flüssigwurmmischung mit 60 Würmern pro Milliliter in S vollständigem Medium vor, das Carbenicillin, Amphotericin B und OP50 enthält.
Geben Sie 120 Mikroliter Medium mit Würmern in die Reihen A bis G und keine Würmer Medium in Reihe H. Verschließen Sie dann die Platte mit einem Klebeband, um Kontamination und Verdunstung zu verhindern. Inkubieren Sie die versiegelten Platten etwa 65 Stunden lang bei 20 Grad Celsius, bis die Tiere zu L4-Würmern werden. Geben Sie 30 Mikroliter einer 0,6-millimolaren Fluordesoxyuridin-Stammlösung in jede Vertiefung, um die Tiere im L4-Stadium zu sterilisieren.
Verschließen Sie die Platte wieder mit Klebebandversiegelern und rühren Sie sie 20 Minuten lang bei 800 U/min auf einem Mikrotiterplattenschüttler. Stellen Sie die Platten wieder in den 20-Grad-Inkubator. Fügen Sie am nächsten Tag die Droge von Interesse zur Kultur des ersten Tages hinzu.
Verschließen Sie die Platten wieder mit einem Bandschweißgerät und schütteln Sie sie 20 Minuten lang bei 800 U/min auf einem Plattenschüttler. Nachdem Sie den Deckel und die Versiegelung entfernt haben, messen Sie den OD600 in einem Plattenleser für die Messung am ersten Tag. Verschließen Sie die Platten wieder und stellen Sie sie wieder in einen 20-Grad-Inkubator.
Zählen Sie mit einem inversen Mikroskop, vorzugsweise mit einem zweifachen Objektiv, die Wurmpopulation in jeder Vertiefung und notieren Sie die Zahlen in einer Tabelle. Geben Sie die Platten nach dem Zählen wieder in den 20-Grad-Inkubator. Die Dosis-Wirkungs-Kurve, eine vollständige Änderung der Nahrungsaufnahme in Abhängigkeit von der Serotoninkonzentration, zeigte, dass der N2-Stamm dosisabhängig zu viel essen kann.
Die daf-16 mu86-Mutante weist eine höhere basale Fütterung auf als N2. Er kann jedoch nicht auf die gleiche dosisabhängige Weise auf Serotonin reagieren wie der N2-Stamm. Ein signifikanter Unterschied wurde in der Nahrungsaufnahme von Würmern beobachtet, die mit Loxapin behandelt, aber mit Bakterien gefüttert wurden, die entweder durch Röntgenstrahlen, Gammastrahlen oder Paraformaldehyd abgetötet wurden. Der Vergleich der Nahrungsaufnahme einer Reihe von genetischen Stämmen zeigte, dass Exc-4- und CGR-1-Mutanten weniger essen, während SRP-6-Mutanten mehr essen.
