Beschriften Sie zunächst zwei Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Pipettieren Sie 50 Mikroliter Aliquots von E.coli DnaK756-Kulturen in die Röhrchen. Legen Sie die Röhrchen auf Eis.
Fügen Sie 10 bis 50 Nanogramm Plasmid-DNA in jedes separate Röhrchen mit den E.coli-Aliquoten hinzu. Lassen Sie die Röhrchen 30 Minuten lang auf Eis. Legen Sie die Zellen anschließend 60 Sekunden lang bei 42 Grad Celsius, um die Zellen mit einem Hitzeschock zu schocken.
Legen Sie die Röhrchen wieder für 10 Minuten auf Eis. Pipettieren Sie 950 Mikroliter frische zweifache Hefe-Trypton-Brühe in die Röhrchen und inkubieren Sie die Röhrchen dann in einem Shaker bei 37 Grad Celsius. Pipettieren Sie 100 Mikroliter der transformierten Zellkultur und verteilen Sie sie auf Agarplatten mit zweifachem Hefetrypton, das Antibiotika enthält.
Zentrifugieren Sie den Rest der Zellen eine Minute lang bei 5.000 g bei vier Grad Celsius. Dekantieren Sie etwa 800 Mikroliter der Brühe. Resuspendieren Sie die pelletierten Zellen in den verbleibenden Medien.
Platten Sie die gewonnenen Zellen auf eine zweifache Hefe-Trypton-Agarplatte und inkubieren Sie dann beide Agarplatten über Nacht bei 37 Grad Celsius. Um die Zellen zu plattieren, verwenden Sie eine sterile Schleife, um eine einzelne Kolonie von den Transformanten aufzunehmen. Impfen Sie es in 10 Milliliter zweifache Hefe-Trypton-Brühe, ergänzt mit Antibiotika.
Bereiten Sie nun serielle Verdünnungen der Zellen von 100 bis 10 bis zum negativen Fünftel in zwei Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen vor. Stellen Sie vor dem Erkennen der Zellen mit Antibiotika und IPTG ergänzte Agarplatten bei 40 Grad Celsius mit teilweise geöffneten Deckeln in einen Ofen. Sobald die Platten trocken genug sind, geben Sie zwei Mikroliter der seriell verdünnten Zellen auf die Agarplatten.
Jede Probe auf zwei separate Platten geben. Inkubieren Sie eine Platte bei der zulässigen Wachstumstemperatur von 37 Grad Celsius und die andere bei der nicht zulässigen Wachstumstemperatur von 43,5 Grad Celsius. Um die Expression rekombinanter Proteine zu bestätigen, verwenden Sie eine sterile Schleife, um einen Teil der verbleibenden Zellen aus derselben Kolonie von Transformanten zu entnehmen.
Impfen Sie die Zellen in 10 Milliliter antibiotisch ergänzte Hefe-Trypton-Brühe. Inkubieren Sie die Kulturen über Nacht auf einem Shaker bei 37 Grad Celsius. Alle E.coli DnaK756-Zellen wuchsen bei der permissiven Wachstumstemperatur von 37 Grad Celsius.
Allerdings wuchsen nur heterologe Zellen, die DnaK und KPf exprimierten, bei der nicht permissiven Wachstumstemperatur. Mutante Zellen, die KPf-V436F exprimieren, wuchsen nur bei 37 Grad Celsius, aber nicht bei 43,5 Grad Celsius.
