Führen Sie zunächst den Boden einer geschnittenen Pipettenspitze mit einem Fassungsvermögen von 200 Mikrolitern in ein vorgefertigtes mikrofluidisches Auffanggerät ein. Pipettieren Sie mit einer Spritze, die mit einem 0,2-Mikrometer-Filter ausgestattet ist, um 400 Mikroliter Beta-Kaseinlösung in den Einlassbehälter des Chips zu injizieren. Den Chip sechs Minuten lang bei 900 g zentrifugieren.
Der Flüssigkeitsstand sollte nun sowohl am Einlass als auch am Auslass gleich sein. Zeichnen Sie einen Umriss des Abstandshalters auf zwei Objektträgern. Reinigen Sie die Objektträger eine Minute lang mit Plasma mit hohem Sauerstoffgehalt, um sie hydrophil zu machen.
Geben Sie Agarose mit niedriger Geliertemperatur auf den Objektträger, bis er vollständig mit Agarose bedeckt ist. Kippen Sie dann den Objektträger in einem Winkel von 90 Grad und lassen Sie überschüssige Agarose auf ein Taschentuch abtropfen. Legen Sie die Objektträger 30 Minuten lang bei 50 Grad Celsius.
Mit einem tragbaren Sonden-Ultraschallgerät, das mit einer Ein-Millimeter-Sonde ausgestattet ist, werden die präparierten Proteoliposomen beschallt. Halten Sie die proteo-SUVs 30 Sekunden lang auf Eis, bevor Sie die Beschallung fünfmal wiederholen. Mit einer 100 Mikroliter Spritze 0,5 Mikroliter Tröpfchen der proteo SUVs auf ein vorbereitetes Agarosegel aufsetzen.
Verwenden Sie den Stickstofffluss für ca. 10 Minuten, um die Tröpfchen zu trocknen. Pipettieren Sie die Quelllösung mit einer Spritze und einer Nadel durch ein kleines Loch an der Seite in eine vorbereitete Kammer und lassen Sie die Vesikel mindestens 30 Minuten lang bei 22 Grad Celsius aufquellen. Klopfen Sie die Kammer auf eine feste Oberfläche, um die GUVs aus dem Gel zu gewinnen.
Um die GUVs für die Mikroskopie einzufangen, montieren Sie einen passivierten Mikrofluidik-Chip an einem Mikroskop. Nachdem Sie auf Defekte geprüft haben, verbinden Sie den Schlauch mit einer gebogenen Nadel mit dem Auslass des Behälters. Nachdem Sie das andere Ende an eine Ein-Milliliter-Spritze angeschlossen haben, montieren Sie die Spritze an eine Pumpe mit einer maximalen Durchflussrate von 10 Mikrolitern pro Minute.
Ersetzen Sie den Waschpuffer des Behälters durch frisches Medium. Mit mindestens 80 Mikrolitern Puffer P waschen.Nachdem Sie den überschüssigen Puffer entfernt haben, geben Sie die proteo GUVs in den Behälter. Überwachen Sie den Chip im Laufe der Zeit, bis genügend GUVs im Chip eingeschlossen sind.
Pipettieren Sie die überschüssige GUV-Lösung heraus. Geben Sie dann den Waschpuffer P mit einer Durchflussrate von 0,1 bis einem Mikroliter pro Minute hinzu. Zum Schluss lokalisieren Sie die Fallen mit einer ausreichenden Menge an Vesikel.
Nachdem Sie die Einstellungen auf das Mikroskop angewendet haben, geben Sie den Puffer R mit einer Durchflussrate von 0,5 Mikrolitern pro Minute in das Reservoir. Die Rehydratation von getrockneten Proteo-LUVs auf einem Agarosegel mit niedriger Geliertemperatur führte zur Bildung von mikrometergroßen Vesikel. Die GUVs wurden geerntet und in einem Beta-Kasein-passivierten mikrofluidischen Gerät gefangen.
