Um mit der durchflusszytometrischen Analyse zu beginnen, stellen Sie zunächst den 785-Nanometer-Laser auf eine Leistung von fünf Milliwatt für Dunkelfeldmessungen ein. Verwenden Sie ein 60-faches Objektiv mit einer numerischen Apertur von 0,9. Wählen Sie dann die Einstellung "Hohe Empfindlichkeit" und stellen Sie die Geschwindigkeit auf "Niedrig" ein.
Um die Stabilität der Kalibrierungsperle sicherzustellen, drücken Sie die Wiedergabetaste im Fluidikfeld und untersuchen Sie die Raupenbilder, die scharf und klar erscheinen sollten. Generieren Sie ein neues Streudiagramm im Arbeitsbereich, indem Sie Neues Streudiagramm auswählen. Wählen Sie dann den Bereich im Hellfeldkanal aus, der der Intensität des SSC-Kanals entspricht, und schließen Sie die Kalibrierungsperlen aus, die gleichzeitig in der Probe ausgeführt werden.
Drücken Sie anschließend die Ladetaste und positionieren Sie ein Röhrchen mit der Laktobazillenprobe in den Halter. Geben Sie im Feld "Erfassungseinstellungen" den Namen des Beispiels ein und geben Sie den Speicherort für die Datenspeicherung an. Legen Sie die Anzahl der zu erfassenden Ereignisse fest, in der Regel im Bereich von 10.000 bis 20.000 Ereignissen.
Beginnen Sie nun den Akquisitionsprozess, indem Sie auf die Schaltfläche Aufzeichnen klicken, die sich im Feld Akquisition befindet. Der Prozess wird nach Erreichen der angegebenen Anzahl von Ereignissen angehalten. Drücken Sie die Return-Taste, um das Rohr zu entladen und aus der Halterung zu entfernen, wie im Popup-Fenster angezeigt.
Nachdem Sie den Vorgang für alle Stichproben wiederholt haben, speichern Sie die Vorlage, um die Einheitlichkeit der Datenerfassung zu gewährleisten. Um die Rohdatei für die Datenanalyse in die Analysesoftware zu laden, klicken Sie auf Datei und öffnen Sie die rif-Datei. Wählen Sie im geöffneten Fenster Akquisitionsanalyse verwenden aus, und klicken Sie dann auf OK. Um als Nächstes ein Histogramm des Gradienten-Mittelwerts zu erstellen, klicken Sie auf die Schaltfläche Neues Histogramm und wählen Sie die zu analysierende Grundgesamtheit aus der Erfassung aus.
Wählen Sie unter der Funktion "X-Achse" die Option "Gradient RMS" des Hellfeldkanals aus. Platzieren Sie als Nächstes ein Gate, um nicht fokussierte Events auszuschließen, indem Sie im Analysebereich auf die Schaltfläche Linienbereich erstellen klicken. Erstellen Sie ein Streudiagramm der Fläche im Vergleich zum Seitenverhältnis, indem Sie im Analysebereich auf die Schaltfläche Neues Streudiagramm klicken.
Wählen Sie die fokussierte Grundgesamtheit im Fenster Neues Streudiagramm aus. Wählen Sie dann den Bereich des Hellfeldkanals für die X-Achsen-Funktion aus. Wählen Sie das Seitenverhältnis für das Y-Achsen-Feature aus.
Zeichnen Sie mit der Schaltfläche Rechteck erstellen ein Tor im Streudiagramm basierend auf dem Flächenwert für die Aggregat-Ereignispopulation. Zeichnen Sie auf ähnliche Weise ein weiteres Tor für die Einzel- und Kleinaggregatpopulation. Speichern Sie Ihre Datenanalyse als Vorlage, indem Sie auf die Registerkarte Datei klicken, Save As Template ast (Als Vorlage speichern) auswählen und dann die nächste Beispieldatei unter derselben Vorlage öffnen, um die Datenanalysedatei zu erstellen.
Um die Verteilung der Aggregatgröße zu messen, erstellen Sie zunächst ein Histogramm des Bereichs der Grundgesamtheit der Aggregationsereignisse. Speichern Sie die Datenanalyse, indem Sie auf die Datei klicken und die Option Als Vorlage speichern auswählen. Öffnen Sie nach dem Speichern die nächste Beispieldatei unter derselben Vorlage für die Datenanalysedatei.
Einzelne Zellen, kleine Aggregate, große Aggregate und Ketten wurden bei LGG und L. paracasei beobachtet, aber es war nicht möglich, zwischen Ketten und größeren Aggregaten zu unterscheiden. Signifikante Unterschiede in den Aggregationseigenschaften verschiedener LAB-Stämme wurden als Reaktion auf fermentierbare oder nicht fermentierbare Zucker beobachtet.
