Legen Sie zunächst die eingeschläferte Maus in Rückenlage auf das Sezierbrett. Mit Hilfe von Dissektions-T-Pins werden die Fußpolster der Maus auf dem Board befestigt. Mit einer chirurgischen Präparierschere den Unterbauch einschneiden und bis zum Kinn schneiden.
Nachdem Sie die Haut von der Bauchfellschleimhaut getrennt haben, dehnen Sie sie senkrecht vom Rumpf weg und stecken Sie sie fest. Entfernen Sie mit einer stumpfen Pinzette vorsichtig die zervikalen, axialen, brachialen und leistenförmigen Lymphknoten sowie die Milz und legen Sie sie in ein 70-Mikrometer-Zellsieb mit zwei Millilitern R9-Medium. Um eine Einzelzellsuspension herzustellen, drehen Sie das Gewebeaufschlusswerkzeug wiederholt um eine halbe Umdrehung im Uhrzeigersinn und gegen den Uhrzeigersinn.
Waschen Sie das Sieb mit fünf Millilitern Medien. Übertragen Sie dann die Zellsuspension in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie es. Geben Sie nach dem Dekantieren des Überstands 500 Mikroliter Lysingpuffer in das Röhrchen, um rote Blutkörperchen zu entfernen.
Mischen Sie die Zellen nach einer Minute mit 9,5 Millilitern R9-Medium. Zentrifugieren Sie das Röhrchen. Und den Überstand gründlich dekantieren.
Als nächstes resuspendieren Sie das Zellpellet in 10 Millilitern negativem Selektionsmedium, das Anti-MHC2- und Anti-CD4-Antikörper enthält, und legen Sie das Röhrchen für 30 Minuten in eine Wippe. Nachdem Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 270 g pelletiert haben, dekantieren Sie den Überstand. Gleichzeitig in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen 200 Mikroliter Schaf-Anti-Ratten- und Immunglobulin-G-Kügelchen in sieben Millilitern einem Medium waschen.
Setzen Sie das Rohr auf einen Magneten und entfernen Sie das Medium. Nachdem Sie die Kügelchen noch zwei Mal gewaschen haben, resuspendieren Sie sie in sieben Millilitern R9 Medium. Mischen Sie dann sieben Milliliter der Bead-Suspension mit dem Zellpellet und inkubieren Sie das Röhrchen auf einer Wippe.
Um an Antikörperkügelchen gebundene Zellen zu entfernen, legen Sie das konische Röhrchen drei Minuten lang direkt auf den Magneten. Saugen Sie die Zellsuspension in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen an, wobei das Röhrchen auf dem Magneten bleibt. Pelletieren Sie die angereicherten CD8-positiven Zellen und waschen Sie sie dreimal in mittlerer Hitze.
