Bereiten Sie zunächst alle erforderlichen Materialien für den Assay vor. Für GSH-Standards geben Sie 40 Mikroliter Gesamtglutathionpuffer in jede Vertiefung. Als nächstes saugen Sie das Medium aus jeder Vertiefung einer Platte mit dem Zellpellet an und waschen Sie die Zelle dreimal mit eiskaltem PBS.
Bereiten Sie den Kalibrierbereich mit 10 Mikrolitern Glutathion und doppelt destilliertem Wasser als Blindwert in dreifacher Ausfertigung vor. Für die gewünschte Zielquantifizierung inkubieren Sie die gewaschenen Zellen mit den entsprechenden Mischungen in einem Orbitalschüttler bei 300 U/min für zwei Minuten. Geben Sie dann fünf Mikroliter 0,01 molare Tris, 2-Carboxyethylphosphinlösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie erneut 10 Minuten lang.
Zentrifugieren Sie anschließend die Platte fünf Minuten lang bei 200 g und überführen Sie 25 Mikroliter aus jeder Probenvertiefung zur Proteinquantifizierung auf eine separate durchsichtige 96-Well-Platte. Geben Sie dann 170 Mikroliter Arbeits-Ortho-Phthalaldehyd-Lösung in jede Vertiefung mit 30 Mikrolitern Proben. Um die Platte vor Licht zu schützen, decken Sie sie gründlich mit einer Folie ab und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang im Orbitalschüttler.
Zum Schluss wird die Fluoreszenz mit einem Plattenlesegerät bei 340 Nanometern Anregung und 450 Nanometern Emission abgelesen. A549-Zellen, die mit verschiedenen Nanomaterialien behandelt wurden, zeigten in diesem Assay unterschiedliche Glutathiondisulfid-Verhältnisse, und der höchste Wert wurde für die Zellen beobachtet, die mit 125 Mikrogramm pro Milliliter Silber behandelt wurden.
