Einbettung von Augengewebe und Kryosektion in eine Verbindung mit optimaler Schnitttemperatur für die Fluoreszenzbildgebung

Nachdem der Kryoschutz des Kaninchenauges abgeschlossen ist, geben Sie es von einer 30%igen Saccharoselösung in eine 100-Millimeter-Sezierschale. Drehen Sie das Auge unter einem Präpariermikroskop vorsichtig um, um überschüssige Saccharoselösung aus dem inneren Teil des Auges zu entfernen. Wischen Sie mit einem Tuch vorsichtig überschüssige Saccharoselösung vom äußeren Teil des Auges ab, füllen Sie eine Einweg-Einbettungsform mit optimaler Schnitttemperatur oder OCT-Verbindung bis zu einer Tiefe von 0,5 bis einem Zentimeter.

Legen Sie das Auge mit dem Gesicht nach oben in die Einbettform und füllen Sie den inneren Teil des Auges langsam mit OCT-Masse, um Blasenbildung zu vermeiden. Sobald das Auge in der OCT-Verbindung hervorgetreten ist und die Innenflächen der Form nicht berührt, wickeln Sie die Einbettungsform in Paraffin ein und lagern Sie es über Nacht bei vier Grad Celsius. Legen Sie die Einbettungsform am nächsten Tag in eine Sezierschale.

Wenn möglich, entfernen Sie die OCT-Verbindung vorsichtig mit einem Tuch von der Innenseite des Auges. Übertragen Sie das Auge in eine neue Einbettungsform, die mit frischer OCT-Masse gefüllt ist. Füllen Sie dann die Form wie zuvor, um sicherzustellen, dass das endgültige Einbettmedium frei von Ablagerungen oder Unvollkommenheiten ist.

Beschriften Sie die Form zur Orientierung. Positionieren Sie das Auge nach oben in der Kryoform, so dass die OCT-Verbindung die innere Netzhaut auskleidet. Verwenden Sie den Sehnervenkopf als Orientierungspunkt zur Bestimmung des oberen Teils des Auges Legen Sie die beschriftete Einbettform auf Trockeneis und achten Sie darauf, dass das Auge die Innenflächen der Form nicht berührt oder der Luft ausgesetzt ist.

Montieren Sie den Block auf dem Kryostaten, wobei der obere Teil des Auges nach oben und der untere Teil nach unten zeigt. Mit der restlichen Hornhaut und Iris nach rechts oder links. Positionieren Sie eine frische Klinge parallel zur vertikalen Achse des Auges, um sie zu schneiden.

Nach dem Schneiden der Abschnitte und dem Trocknen über Nacht stellen Sie einen Objektträger bei 80 Grad Celsius in einen Gefrierschrank. Die Fluoreszenzbilder einer ganzen retinalen Kryosektion von Kaninchenauge zeigten eine gleichmäßig pigmentierte retinale Pigmentepithelschicht ohne signifikante Ablösung von der darüber liegenden Photorezeptorschicht. Ein Hellfeldbild des Netzhautschnitts zeigt außerdem eine intakte Netzhautmorphologie aller Schichten.