Öffnen Sie zunächst die Software und wählen Sie die Option zum Erstellen einer neuen DNA-Datei. Bereiten Sie die PRRSV-Gensequenz aus NCBI vor und klicken Sie auf OK, um die Sequenzdateien zu generieren. Analysieren Sie die Sequenz, und markieren Sie die Fragmentknoten.
Identifizieren Sie alle Verbindungen, bevor Sie die spezifischen Sequenzprimer für die Fragmente entwerfen. Klicken Sie dann auf Primer und wählen Sie Add Primer. Fügen Sie die spezifische Sequenz ein und fügen Sie Überlappungssequenzen des Vektors zu den ersten fünf Primnukleotiden des Primers hinzu.
Benennen Sie die Vorwärtsprimer und klicken Sie auf Primer zur Vorlage hinzufügen, um die entworfene Grundierung in die Vorlage zu integrieren. Markieren Sie dann die Fragmentverbindungen und entwerfen Sie den umgekehrten spezifischen Sequenzprimer der Fragmente. Navigieren Sie erneut zu Primer und wählen Sie Primer hinzufügen aus.
Geben Sie die spezifische Reihenfolge ein. Fügen Sie die Restriktionsstelle zu den ersten fünf Primenukleotiden hinzu. Schließen Sie außerdem 20 bis 40 Basenpaare von Vektorüberhangsequenzen zu den ersten fünf Primenukleotiden der Restriktionsstelle ein.
Benennen Sie die umgekehrte Grundierung und wählen Sie "Grundierung zur Vorlage hinzufügen" aus. Als nächstes richten Sie sechs einzelne PCR-Reaktionen mit den sechs Fragmenten ein und entwerfen Primerpaare. Führen Sie die PCR nach einem dreistufigen Protokoll durch, wie hier gezeigt.
Pipettieren Sie nach Abschluss der PCR einen Mikroliter mit sechs xDNA-Ladepuffern mit fünf Mikrolitern des PCR-Produkts. Mischen und kurz zentrifugieren. Analysieren Sie die Proben mit 1%Agarose-Gelelektrophorese.
Um ein Gen in voller Länge zu konstruieren, wurden Insert-Fragmente von PRRSV mit sechs PCR-Reaktionen amplifiziert. Die Größe der Fragmente wurde durch Agarose-Gelelektrophorese bestätigt.
