Beginnen Sie mit der Linearisierung des Vektors. Das Reaktionsgemisch mit spezifischen Restriktionsenzymen wird bei Raumtemperatur hergestellt. Verwenden Sie ein Gel-Extraktionskit, um die linearisierten Vektoren zu reinigen, und inkubieren Sie dann 60 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.
Assemblieren Sie dann die nahtlose Klonierungs- und Assemblierungsreaktion des Exons R, um das PRRSV-Gen zu subklonieren. Das Gesamtreaktionsvolumen wird mit sterilisiertem entionisiertem Wasser auf 10 Mikroliter eingestellt. Dann gründlich mischen.
Inkubieren Sie die Mischung in einem Thermocycler für 15 bis 60 Minuten bei 50 Grad Celsius. Anschließend lagern Sie die Proben auf Eis. Nachdem Sie den Vektor in kompetente Zellen umgewandelt haben, wählen Sie acht Kolonien in 20 Mikroliter LB-Medium, das Kanamycin enthält.
Richten Sie eine Kolonie-PCR-Reaktion ein, um die Transformanten zu analysieren. Ein PRRSV-Überexpressionsvektor in voller Länge wurde erhalten, indem das erste PRRSV-Fragment in den pVAX1-Vektor eingeführt wurde, wodurch pVAX1-F1 entstand. Aufeinanderfolgende Rekombinationsrunden mit spezifischen Restriktionsenzymen führten zum Einbau der Fragmente zwei bis fünf, was durch eine Zunahme der Plasmidgröße sichtbar wurde.
