Nehmen Sie zunächst die aufgetauten Proben von Salmonellen-infiziertem Mausgewebe mit einer Pinzette auf. Setze es schnell in den Boden einer Kunststoffform ein, die flüssige Agarose enthält. Sobald die Polymerisation abgeschlossen ist, öffnen Sie die Kunststoffform mit einem Skalpell von den Ecken aus.
Nachdem Sie eine Klinge auf ein Mikrotom gelegt haben, übertragen Sie die Probe mit behandschuhten Fingern in eine Probenbox. Positionieren Sie die Probe so unter dem Mikrotom, dass sich die Oberseite der Agarose auf gleicher Höhe mit der Klinge des Mikrotoms befindet. Bewegen Sie die Bühne, um den Agarose-Würfel in der Mitte des Ziels zu platzieren.
Klicken Sie in der Tomographen-Software auf die Schaltfläche Slice, bis eine vollständige intakte Scheibe des Würfels erhalten wird. Zentrieren Sie als Nächstes die Objektivlinse in x- und y-Richtung auf die Gewebeprobe. Starten Sie die Lasersoftware, stellen Sie die Wellenlänge auf 800 Nanometer ein und schalten Sie dann den Laser ein.
Schließen Sie die Schranktüren des Mikroskops. Schalten Sie dann alle Lichtquellen im Raum aus. Schalten Sie die PMTs ein und stellen Sie die Spannung auf 750 Volt ein.
Stellen Sie nun den Mikroskopverschluss auf automatisch. Stellen Sie dann die Spannungen von V1 und V2 auf 20 bzw. 1,71 ein. Stellen Sie die Z-Achse mit dem Z-Piezo-Gerät ein, bis sie die Gewebeoberfläche erreicht.
Schneiden Sie mehrere Scheiben mit einer Dicke von 50 Mikrometern. Als nächstes wird zur Suche nach den Probenkanten der Bildgebungsbereich auf das Gewebe beschränkt, wobei die umgebende Agarose nur minimal abgebildet wird. Stellen Sie nach dem Ausschalten der PMTs die Wellenlänge des Lasers auf 800 Nanometer ein.
Verwenden Sie den Laserspot, um die Koordinaten der Geweberänder zu finden, während Sie den Tisch verschieben. Nach Bestätigung der Koordinaten positionieren Sie den Laserspot in der rechten vorderen Mitte. Ändern Sie nun die Wellenlänge auf 940 Nanometer.
Stellen Sie den Mikroskopverschluss auf den Automatikmodus und dann die Verschlussspannung auf 20 für V1 und 1,71 für V2. Drücken Sie die Einstellungsoption 3D-Mosaik, um mit dem Scannen zu beginnen. Entnehmen Sie nach der Bildgebung die Gewebeschnitte aus dem Wassertank. Um die Kachelbilder zusammenzufügen, übertragen Sie zunächst Daten vom Tomographenserver auf den Linux-Rechner.
Öffnen Sie das MATLAB-Skript StepOneStitchingAndArchive. m und suchen Sie den Quellordner. Wechseln Sie zur Registerkarte Editor und klicken Sie auf Ausführen.
Die Fortschrittsinformationen werden im Befehlsfenster angezeigt. Suchen Sie die zusammengefügten Bilder im Unterordner stitchedimages_100 im Quellordner. Komprimieren Sie die Rohdaten mit dem Befehl tar und speichern Sie sie als einzelne Datei mit der Dateinamenerweiterung tar.bz2.
Um die Support-Vektormaschine zu trainieren, zeigen Sie eine Vorschau der zusammengefügten Bilder an. Öffnen Sie ein Bild mit demselben Dateinamen aus jedem Unterordner mit Fiji. Führen Sie die drei Kanäle zu einem Farbbild zusammen und passen Sie dann die Helligkeit jedes Kanals an, bis klare Signale von Bakterien und Gewebe-Autofluoreszenz zu sehen sind.
Beachten Sie die eingestellte maximale Intensitätsstufe jedes Kanals. Öffnen Sie als Nächstes das MATLAB-Skript StepTwoSegmentationAndAnalysis.m. Definieren Sie den Quellordner und die Bildnamen für das Training, gehen Sie dann auf die Registerkarte Editor und klicken Sie auf Ausführen.
Wenn ein Dialogfeld angezeigt wird, in dem Sie nach Farbschwellenwerten gefragt werden, füllen Sie es mit den Werten, die auf der vorherigen manuellen Überprüfung mit Fiji basieren. Wählen Sie Regionen für den Hintergrund und interessante Bereiche entsprechend den Dialogen aus. Es werden Diagramme angezeigt, die anzeigen, wie gut das Modell trainiert wurde, und in denen gefragt wird, ob weitere Regionen hinzugefügt werden müssen.
Fügen Sie weitere Bereiche von Interesse und Hintergrund hinzu, bis die Bakterien eindeutig segmentiert werden können. Der Segmentierungsprozess wird automatisch ausgeführt, und der Fortschritt wird im Befehlsfenster angezeigt. Öffnen Sie als Nächstes die Bilder des blauen Kanals, die die zweite Harmonische des Kollagens enthalten.
Biegen Sie die Bilder des ersten Kanals sowohl in der x- als auch in der y-Achse um das Zehnfache und speichern Sie die verkleinerten Bilder in einem neuen Ordner. Erstellen Sie drei Replikate von verkleinerten Bildern im selben Ordner. Starten Sie für die 3D-Visualisierung das Imaris Visualisierungssoftwarepaket in der Arenaansicht.
Öffnen Sie nun die IMS- oder TIF-Datei. Passen Sie die Farbdarstellungen der verschiedenen Kanäle im Anzeigeanpassungsfenster an. Klicken Sie im Menü Bearbeiten auf Bildeigenschaften, um die Minimal- oder Maximalwerte und einen Wert für die Gammakorrektur manuell festzulegen.
Nachdem Sie das Erscheinungsbild des Bildes angepasst haben, exportieren Sie die aktuelle Ansicht mit dem Schnappschuss-Werkzeug. Verwenden Sie den Navigationszeiger, um eine Ansicht zu suchen, und verwenden Sie dann das Pluszeichen Hinzufügen, um Schlüsselbilder hinzuzufügen. Verwenden Sie das Symbol Animation, um die 3D-Daten als Film darzustellen.
Drücken Sie die rote Aufnahmetaste, um den Film zu erstellen, und speichern Sie ihn dann im gewünschten Zielordner und Dateityp. Einzelne Salmonellenzellen wurden in ganzen Organen der Maus nachgewiesen, etwa in der Milz, der Leber, den mesenterialen Lymphknoten und den Peyer-Pflastern. Die Segmentierung fluoreszierender Bakterien wurde immunhistochemisch bestätigt.
Wirtszellen wurden in vivo gefärbt, indem vor der Perfusion ein Antikörper in Oberflächenmarker injiziert wurde.
