Beginnen Sie mit der Durchführung des MM QPCR-Assays zur Messung der Telomerlänge. Öffnen Sie dann die Software und wählen Sie die Funktion zum Einrichten der Platte. Wählen Sie danach die Option Platte anzeigen oder bearbeiten aus dem Dropdown-Menü.
Markieren Sie nun alle Vertiefungen auf dem Teller. Klicken Sie auf Floraphoren auswählen. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen mit der Bezeichnung Cyber und stellen Sie sicher, dass alle anderen Kontrollkästchen deaktiviert sind.
Klicken Sie dann zur Bestätigung auf OK. Während Sie die Hervorhebung auf allen Wells beibehalten, suchen und aktivieren Sie das Kontrollkästchen neben Cyber neben dem Wort load, um alle Wells mit Cyber zu beschriften. Markieren Sie nun die drei Nicht-Template-Kontroll-Wells, die entweder oben oder unten in der seriellen Standard-Kontrollverdünnung positioniert sind.
Wählen Sie dann im Menü "Sample-Typ" auf der rechten Seite die Option "NTC" aus. Markieren Sie die 21 Vertiefungen, aus denen sich die serielle Standardverdünnung der Kontrolle zusammensetzt, und wählen Sie Standard aus dem Menü "Probentyp" aus. Während diese Vertiefungen noch ausgewählt sind, klicken Sie auf Technisches Replikat und wählen Sie im Menü für die Replikationsgröße drei aus.
Wählen Sie dann horizontal und klicken Sie auf Anwenden. Scrollen Sie danach nach unten zum Abschnitt Verdünnungsreihe und geben Sie zwei in das Feld für den Verdünnungsfaktor ein. Geben Sie für die P1-Platte zweimal 10 hoch minus drei in das Start-Konzentrationsfeld ein.
Aktivieren Sie dann das Kästchen zum Verringern und klicken Sie auf Übernehmen, um die Einstellungen zu bestätigen. Geben Sie für die P2-Platte 3,13 mal 10 hoch minus fünf in das Start-Konzentrationsfeld ein. Stellen Sie sicher, dass Sie das Kontrollkästchen für die Erhöhung aktivieren, und wählen Sie dann Anwenden aus, um das Setup abzuschließen.
Markieren Sie nun die Spalten für PCR-Streifen A aus dem Menü "Probentyp", wählen Sie "Unbekannt" und fahren Sie dann mit der Auswahl "Technische Replizierung" fort. Wählen Sie im Menü "Größe replizieren" drei aus und wählen Sie "Horizontal", bevor Sie auf "Anwenden" klicken. Klicken Sie unten rechts im Fenster des Platteneditors auf OK.
Bestätigen Sie die Änderungen, indem Sie auf Ja klicken, wenn Sie dazu aufgefordert werden. Stellen Sie als Nächstes sicher, dass die Kurven auf der Registerkarte Quantifizierung sowohl für Schritt neun als auch für Schritt 12 geeignet erscheinen und dass die Effizienzwerte zwischen diesen beiden Schritten nicht um mehr als 10 % voneinander abweichen. Wählen Sie für P1 Schritt neun aus, und markieren Sie die 21 Wells, die der Standardkurve entsprechen. Kopieren Sie die CQ-Werte aus der unteren rechten Ecke des Softwarefensters.
Öffnen Sie dann die Vorlage für das Telomerdatenblatt, und fügen Sie diese Werte in die Standardspalte B ein. Geben Sie anschließend den Steigungswert von Schritt neun in Zelle C vier im Standardblatt ein und überprüfen Sie, ob der Variationskoeffizient für jedes Standardverdünnungsdreifaches unter 0,1 liegt. Schließen Sie unter CFX alle Ausreißerdatenpunkte aus der Analyse aus, die dazu führen, dass ein Satz von Triplikaten außerhalb des Bereichs liegt. Vergewissern Sie sich nun, dass nur die 72 Probenvertiefungen in der P1-Analysedatei auf der Registerkarte Quantifizierung blau hervorgehoben sind.
Kopieren Sie dann in Schritt neun die CQ- und SQ-Werte, die sich in der unteren rechten Ecke des Softwarefensters befinden, und fügen Sie sie in das Beispielblatt P1 ein, beginnend bei Zelle D3. Stellen Sie mit CFX Maestro sicher, dass alle CQ-Werte für analytische Proben im Bereich der niedrigsten und höchsten CQ-Werte der Standardkurve liegen. Überprüfen Sie in der Excel-Tabelle, ob die Ausgangskonzentration im NTC weniger als 5 % der durchschnittlichen DNA-Menge in den Probenvertiefungen beträgt. Zur Qualitätskontrolle auf Probenebene sind die Standardabweichungen und der Variationskoeffizient in den Spalten J und K auf den Probenblättern P1 und P2 zu untersuchen.
Stellen Sie sicher, dass die CVs der einzelnen Proben zwischen den Platten im P1- und P2-Blatt, insbesondere in Spalte G, 0,05 nicht überschreiten. Wenn die CV zwischen den Platten einer Probe höher als akzeptabel ist, entfernen Sie bis zu einem Dreifachen aus der Berechnung für jede Probe. Überprüfen Sie für die Qualitätskontrolle auf Plattenebene, ob die durchschnittliche Abweichung zwischen den Platten über alle Proben auf jeder Platte hinweg weniger als 0,05 beträgt.
Wenn die CV zwischen den Platten einer Probe höher als akzeptabel ist, entfernen Sie bis zu einem Dreifachen aus der Berechnung für jede Probe. Um eine zusätzliche Qualitätskontrolle auf Plattenebene durchzuführen, stellen Sie sicher, dass die Gesamtabweichung zwischen den Platten zwischen P1 und P2 weniger als 0,06 beträgt.
