Aufbereitung von konditionierten Medien für humane Meningealzellen (HMC) und Entnahme von Liquor cerebrospinalis für die Kultivierung zirkulierender Tumorzellen

Zu Beginn wird ein T175-Kolben mit Poly-L-Lysin vorbeschichtet. Stellen Sie den Kolben für eine Stunde bei 37 Grad Celsius in einen Inkubator. Verwenden Sie nun eine sterile serologische Pipette, um die Lysinlösung zu aspirieren.

30 Milliliter vollständiges Meningealkulturmedium, das menschliche Meningealzellen enthält, in den Kolben pipettieren. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius unter 5% Kohlendioxid-Supplementierung. Wenn die Zellen eine Konfluenz von etwa 75 % bis 80 % erreichen, sammeln Sie die HMC-Kulturmedien und bewahren Sie sie in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen auf.

Geben Sie dann das komplette meningeale Kulturmedium im Verhältnis eins zu eins in das Röhrchen. Pipettieren Sie abschließend die Wachstumsfaktoren in das Röhrchen, um das HMC-konditionierte Medium herzustellen. Um die zerebrale Rückenmarksflüssigkeit zu verarbeiten, legen Sie sie zunächst in ein 15 Milliliter konisches Röhrchen auf Eis, um sie abzukühlen.

Die Flüssigkeit wird in einer vorgekühlten Zentrifuge bei 257 g fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius zentrifugiert. Pipettieren Sie den Überstand heraus, ohne das Küvettenpellet zu stören, und machen Sie Aliquote davon in verschiedenen Röhrchen. Fügen Sie nun einen Milliliter PBS zum Zellpellet hinzu, um es wieder aufzusetzen.

Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1.500 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Saugen Sie den PBS-Überstand an, während Sie etwa 50 Mikroliter davon am Boden des Rohrs belassen. Führen Sie eine Zellzählung mit der Zellsuspension durch, bevor Sie die Zellen kultivieren.

Mehrere Wachstumsfaktoren wurden in den Medien hochreguliert, die mit menschlichen Meningealzellen kultiviert wurden.