Vorbereitung kryokonservierter RSC96-Zellen für die Stimulation des gepulsten elektrischen Feldes in Nanosekunden

Stellen Sie zunächst das Kryo-Fläschchen mit einem Milliliter RSC96-Zellsuspension in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad und schütteln Sie es schnell. Die Zellsuspension wird in ein Zentrifugenröhrchen mit vier bis sechs Millilitern vollständigem Kulturmedium überführt und gut vermischt. Zentrifugieren Sie das Röhrchen drei bis fünf Minuten lang bei 1.000 g, verwerfen Sie dann den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in drei Millilitern vollständigem Kulturmedium.

Geben Sie nun die Zellsuspension in einen Kulturkolben mit 628 Millilitern vollständigem Kulturmedium und inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius. Sobald die Zelldichte 80 bis 90 % erreicht, verwerfen Sie das Kulturmedium und spülen Sie die Zellen ein- bis zweimal mit PBS ohne Kalzium- und Magnesiumionen. Dann gib 0,25 % Trypsin, 0,53 millimolare EDTA in den Kulturkolben.

Beobachten Sie am Ende der Inkubation die Zellablösung unter dem Mikroskop. Sobald die meisten Zellen rund und abgelöst sind, stellen Sie den Kolben schnell wieder in den Arbeitsbereich und klopfen Sie vorsichtig darauf. Fügen Sie drei bis vier Milliliter Kulturmedium mit 10 % FBS hinzu, um die Verdauung zu stoppen.

Mischen Sie dann den Inhalt des Kolbens gründlich und saugen Sie die Lösung ab. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension. Fügen Sie 1.000 g für fünf Minuten hinzu.

Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, resuspendieren Sie die Zellen in ein bis zwei Millilitern frischem Kulturmedium durch vorsichtiges Pipettieren. Übertragen Sie die Zellsuspension in einen neuen T25-Kolben. Fügen Sie ein Verhältnis von eins zu zwei hinzu und fügen Sie sieben Milliliter Nährmedium hinzu.