Beginnen Sie mit der Transfizierung von HEK 293 T-Zellen. Entfernen Sie drei Tage nach der Transfektion das Medium aus den Vertiefungen und waschen Sie es einmal mit PBS. Geben Sie 500 Mikroliter Trypsin in jede Vertiefung.
Fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren, um alle Zellen von der Platte zu lösen. Geben Sie dann 500 Mikroliter des kompletten DMEM-Mediums in jede Vertiefung und resuspendieren Sie die Zellen. Übertragen Sie alle Zellen aus jeder Vertiefung in 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.
Anschließend zwei Minuten bei 1.000 g bei Raumtemperatur zentrifugieren. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch Pipettieren und waschen Sie das Pellet einmal mit einem Milliliter PBS. Entfernen Sie auch hier vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 500 Mikrolitern PBS.
Übertragen Sie die Zellen in FACS-Röhrchen. Untersuchen Sie die Zellen mit einem Durchflusszytometer. Laden Sie die nicht resezierte Zellsuspension.
Drücken Sie auf dem Arbeitsblatt der Durchflusszytometrie auf Erfassen und passen Sie die Vorwärts- und Seitenstreuspannungen an. Um die Zellen im mittleren Bereich zu positionieren, schließen Sie das Tor um diese Population R1 an, um die Ablagerungen im unteren linken Quadranten auszuschließen. Ändern Sie das Gate von FL1, FL2 Dot Blot in G R1. Wählen Sie das Quad-Gating-Werkzeug aus und klicken Sie auf das obere rechte Ende der Zellpopulation im FL1/FL2-Dot-Blot als G R1. Passen Sie die FL1/FL2-Spannungen an, um die Zellen im unteren linken Quadranten zu positionieren.
Drücken Sie Pause und Abbrechen. Laden Sie dann die einfarbigen GFP-Kontrollzellen. Drücken Sie Acquire und passen Sie die Kompensation an, um die GFP-positiven Zellen im unteren rechten Quadranten zu positionieren.
Drücken Sie Pause und Abbrechen. Laden Sie als Nächstes die einfarbigen mCherry-Kontrollzellen. Drücken Sie Acquire und passen Sie die Kompensation an, um die positiven mCherry-Zellen im oberen linken Quadranten zu positionieren.
Drücken Sie Pause und Abbrechen. Klicken Sie in der Menüleiste auf "Erwerben" und wählen Sie "Erfassungsspeicher" aus. Wählen Sie unter Erfassungskriterien die Option Erfassung wird beendet, wenn 10.000 G1 R1-Ereignisse gezählt werden.
Deaktivieren Sie das Häkchen bei Setup. Laden Sie die Probenzellen. Drücken Sie Acquire und warten Sie, bis 10.000 G1 R1-Zellen gezählt wurden.
Wiederholen Sie dies auch für andere Stichproben und Kontrollen.
