Importieren Sie zunächst alle Faxdateien in das Analyse-Dashboard. Öffnen Sie eine der Dateien, um das Streudiagramm der Vorwärtspunktseite anzuzeigen. Erstellen Sie ein Polygon-Gate, um intakte Zellen zu isolieren und Ablagerungen in der unteren linken Ecke des Diagramms zu vermeiden.
Beschriften Sie die Teilgesamtheit als intakte Zellen und ziehen Sie dieses Tor in die Leiste "Alle Stichproben". Überprüfen Sie das Gating für jedes Beispiel, indem Sie die Schaltfläche "Nächstes Beispiel" verwenden. Doppelklicken Sie auf die Subpopulation der intakten Zellen der negativen Kontrollstichprobe, um ein neues Diagramm aufzurufen.
Passen Sie die Plotachse auf FL1-H auf der X-Achse an, um GFP darzustellen, und FL2-H auf der Y-Achse, die mCherry darstellt. Wählen Sie als Nächstes das Quad-Gating-Tool aus und klicken Sie auf das obere rechte Ende der negativen Zellpopulation. Ziehen Sie die vier rechteckigen Gates auf die Leiste mit den intakten Zellen.
Untersuchen Sie jedes Muster von GFP- oder mCherry-Einfarbsteuerungen mit der Schaltfläche "Nächstes Beispiel" auf korrektes Gating. Navigieren Sie zum Layout-Editor. Wählen Sie hier repräsentative Plots aus und wählen Sie In Layout-Editor kopieren.
Wählen Sie alle repräsentativen Diagramme aus und doppelklicken Sie dann, um die Diagrammdefinition zu öffnen. Benennen Sie die Beschriftung der X-Achse als GFP und die Beschriftung der Y-Achse als mCherry. Bestimmen Sie die relative DNA-Reparatureffizienz, indem Sie die Anzahl der GFP-positiven Zellen mit der Anzahl der mCherry-positiven Zellen innerhalb desselben Diagramms vergleichen.
Es wurde eine geeignete Vergütungsanpassungs- und Gating-Strategie implementiert, um die Genauigkeit der NHEJ- und HR-Analyse zu gewährleisten. Diese Strategie positionierte GFP-positive Zellen im unteren rechten Quadranten und mCherry-positive Zellen im oberen linken Quadranten. Der Prozentsatz der GFP-positiven Zellen zeigte die DNA-DSB-Reparatur und die Transfektionseffizienz an.
Umgekehrt spiegelte der Prozentsatz der mCherry-positiven Zellen nur die Transfektionseffizienz wider. Die DNA-DSB-Reparatureffizienz wurde als Verhältnis von GFP-positiven zu mCherry-positiven Zellen berechnet. Zusätzlich wurde die Rolle des Wiskott-Aldrich-Syndrom-Proteins und des SCAR-Humalog- oder WASH-Proteins bei der DNA-Reparatur mit dem NHEJ-Assay an shCONTROL- und shWASH-Zellen nachgewiesen.
Der Verlust von WASH verringerte die Effizienz von NHEJ, was seine Rolle bei der Förderung von NHEJ unterstreicht.
