Tauen Sie zunächst das enzymatische Zellverdauungsreagenz 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius auf. Beobachten Sie unter einem Hellfeldmikroskop bei 10-facher Vergrößerung die differenzierten dreidimensionalen menschlichen Darmorganoide, um die Zellgesundheit zu gewährleisten. Ersetzen Sie das Medium aus den Vertiefungen einer 24-Well-Platte, die differenzierte Organoide enthält, durch 500 Mikroliter Kaltzellen-Rückgewinnungslösung.
Pipettieren Sie auf und ab, um die Zellen von der Basalmembran zu lösen. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Inkubieren Sie das Röhrchen 10 Minuten lang auf Eis und pipetieren Sie alle fünf Minuten auf und ab.
Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 400 g drei Minuten lang bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand aus dem Rohr, ohne das Pellet zu stören. Resuspendieren Sie das Pellet in 500 Mikrolitern vorgewärmtem enzymatischem Zellverdauungsreagenz und pipettieren Sie 10 Mal auf und ab.
Legen Sie die Organoide für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius in einen Kohlendioxid-Inkubator. Pipettieren Sie alle 10 Minuten das gesamte Volumen 10 Mal mit einer P1000-Pipette, um die Dissoziation der Zellen zu unterstützen. Die Zellsuspension wird bei 400 g drei Minuten lang bei vier Grad Celsius zentrifugiert und das Pellet in einem Milliliter Differenzierungsmedium resuspendiert.
Pipettieren Sie die Zellen schnell 50 Mal auf Eis auf und ab, um Organoide in einzelne Zellen zu dissoziieren. Filtern Sie das gesamte Volumen durch ein 70-Mikron-Sieb und sammeln Sie das Eluat in einem frischen 1,5-Milliliter-Röhrchen. Filtrieren Sie dann das durch ein 70-Mikron-Sieb gewonnene Eluat auf einem 40-Mikron-Sieb.
Geben Sie fünf Mikroliter 0,4 % Trypanblau zu fünf Mikrolitern Zellsuspension und zählen Sie lebensfähige Einzelzellen mit Trypanblau-Ausschluss. Verdünnen Sie die Probe mit Zellkulturmedien, um 1000 Zellen pro Mikroliter zu erhalten. Insgesamt wurden 4.402 Einzelzellen aus differenzierten ilealen dreidimensionalen humanen Darmorganoiden isoliert, die die erwarteten Zelltypen repräsentieren, einschließlich absorbierender Enterozyten und sekretorischer Zellen.
