Legen Sie zunächst das 15-Milliliter-Röhrchen mit dem vorgewärmten enzymatischen Zellverdauungsreagenz bis zur Verwendung in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator. Aliquotieren Sie 500 Mikroliter frisch zubereitetes PBS/EDTA in die Vertiefungen einer 24-Well-Platte. Beobachten Sie unter einem Hellfeldmikroskop das Wachstum differenzierter dreidimensionaler menschlicher Darmorganoide und Transwells.
Übertragen Sie die Zellkultureinsätze aus dem Wachstumsmedium in die PBS/EDTA-Lösung. Entfernen Sie das Nährmedium von der apikalen Seite und ersetzen Sie es durch 100 Mikroliter PBS/EDTA, ohne die Zellschicht zu stören. Nachdem Sie PBS/EDTA entsorgt haben, nehmen Sie den Einsatz aus der Vertiefung, tupfen Sie ihn vorsichtig auf den Rand eines Papiertuchs und legen Sie ihn umgedreht auf die Tischplatte.
Schneide mit einer scharfen Skalpellklinge um den Innenumfang der Membran herum, um die Membran von der Einlage zu entfernen. Übertragen Sie die Membran mit einer Pinzette in das 1,5-Milliliter-Röhrchen mit 200 Mikrolitern vorgewärmtem enzymatischem Zellverdauungsreagenz. Legen Sie die Membran für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius in einen Kohlendioxid-Inkubator.
Pipettieren Sie alle 10 Minuten das gesamte Volumen fünfmal mit einer Pipette P 200. Alle 10 Minuten ein bis zwei Mikroliter Zellsuspension auf einen Objektträger übertragen, um die Dissoziation durch qualitative Beurteilung des Prozentsatzes einzelner Zellen zu beurteilen. Kombinieren Sie nach der Dissoziation drei Replikat-Wells pro Bedingung in einem einzigen 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.
Geben Sie 400 Mikroliter Zellkultur-Differenzierungsmedium mit 10 mikromolaren ROCK-Inhibitoren hinzu und mischen Sie es vorsichtig durch Pipettieren. Filtern Sie das gesamte Volumen durch ein 70-Mikron-Sieb und sammeln Sie den Durchfluss in einem frischen 1,5-Milliliter-Röhrchen. Filtern Sie dann den Durchfluss, der durch ein 70-Mikron-Sieb auf einem 40-Mikron-Sieb erhalten wird.
Fügen Sie fünf Mikroliter 0,4 % Trypanblau zu fünf Mikrolitern Zellsuspension hinzu und zählen Sie lebensfähige Einzelzellen. Verdünnen Sie die Probe mit WRNE-Wachstumsmedium, um 1.000 Zellen pro Mikroliter zu erhalten. Insgesamt wurden 5.623 Einzelzellen aus differenzierten jejunalen humanen Darmorganoiden isoliert, die auf Membranzellkulturinsertionen gezüchtet wurden.
