Herstellung von Einzelzellsuspensionen aus humanen Darmorganoiden, differenziert als 96-Well-Monoschichten

Bereiten Sie zunächst ein enzymatisches Zellverdauungsreagenz und PBS/EDTA für die Verdauung von menschlichen Darmorganoiden vor. Unter einem Hellfeldmikroskop bestätigen Sie das Wachstum von differenzierten dreidimensionalen menschlichen Darmorganoiden als Monoschichten. Entsorgen Sie das Zellkulturmedium aus der Monolayer-Kultur und ersetzen Sie es durch 100 Mikroliter PBS/EDTA.

Nach dem Entfernen von PBS/EDTA geben Sie 100 Mikroliter warmes enzymatisches Zellverdauungsreagenz in jede Vertiefung. Legen Sie die Platte bei 37 Grad Celsius in einen 5%igen Kohlendioxid-Inkubator und pipettieren Sie das gesamte Volumen fünfmal alle 10 Minuten für 20 bis 30 Minuten. Übertragen Sie alle 10 Minuten ein bis zwei Mikroliter Zellsuspension auf einen Objektträger, um die Dissoziation zu beurteilen, indem Sie den Prozentsatz der einzelnen Zellen beobachten.

Kombinieren Sie nach der Dissoziation drei Replikat-Wells pro Bedingung in einem einzigen 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. 700 Mikroliter Zellkultur-Differenzierungsmedium mit 10 mikromolaren ROCK-Inhibitoren zugeben und durch Pipettieren vorsichtig mischen. Filtern Sie das gesamte Volumen durch ein 70-Mikron-Sieb und sammeln Sie den Durchfluss in einem frischen 1,5-Milliliter-Röhrchen.

Filtern Sie den Durchfluss, der durch ein 70-Mikron-Sieb auf einem 40-Mikron-Sieb erzielt wird. Fügen Sie fünf Mikroliter 0,4 % Trypanblau zu fünf Mikrolitern Zellsuspension hinzu und zählen Sie lebensfähige Einzelzellen. Verdünnen Sie die Probe mit Zellkulturmedien, die den ROCK-Inhibitor enthalten, um 1.000 Zellen pro Mikroliter zu erhalten.

Insgesamt wurden 9.952 Einzelzellen aus differenzierten intestinalen menschlichen Darmorganoiden isoliert, die in 96-Well-Platten gezüchtet wurden.