Großmaßstabsgetreue Konstruktion von UAS-cDNA/ORF-Plasmiden durch CRISPR-basierte modulare Anordnung (CRISPRmass)

Um die parallelen zweistufigen Reagenzglasreaktionen der CRISPR-basierten modularen Baugruppe oder CRISPRmass durchzuführen, fahren Sie fort, die identischen Vektorrückgrate der cDNA/ORF-Plasmide durch Cas9 sgRNA im ersten Reaktionsschritt des Reagenzglases zu spalten. Ordnen Sie dazu ordnungsgemäß beschriftete 0,2-Milliliter-Röhrchen in einem Aluminium-Kühlblock auf Eis an. Bereiten Sie den Mastermix für die Anzahl von N Reaktionen vor, indem Sie entsprechende Mengen Cas9, sgRNA, Cas9-Puffer und DEPC-behandeltes Wasser mischen.

Sobald die Komponenten des Mastermixes zusammengefügt sind, wirbeln Sie sie ein, um eine ordnungsgemäße Mischung zu gewährleisten. Schleudern Sie dann den Mix herunter und aliquotieren Sie zwei Mikroliter des Mastermixes auf jedes 0,2-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie als Nächstes 0,4 Mikroliter 0,019 mikromolares cDNA/ORF-Plasmid in jedes Röhrchen.

Inkubieren Sie Spaltreaktionen bei 37 Grad Celsius für eine Stunde. In der folgenden Reagenzglasreaktion, Schritt zwei, setzen Sie ein vektorspezifisches UAS-Modul in die resultierenden Cas9-linearisierten cDNA/ORF-Plasmide ein. Um die 1,4-Mikroliter-Einzelschrittreaktion für jede Probe einzurichten, ordnen Sie die markierten 0,2-Milliliter-Röhrchen in einem Aluminiumkühlblock auf Eis an.

Bereiten Sie den Mastermix für N Reaktionen vor, indem Sie geeignete Mengen des UAS-Moduls und des einstufigen Mastermixes der Reaktionsanordnung mischen. Den Mix gut einreiben, bevor man ihn herunterschleudert. Aliquotieren Sie dann 0,77 Mikroliter des Mastermixes auf jedes Röhrchen.

Geben Sie 0,7 Mikroliter linearisiertes Cas9-cDNA/ORF-Plasmid in jedes Röhrchen zum Aliquot und inkubieren Sie Reaktionen eine Stunde lang bei 50 Grad Celsius.