Entnehmen Sie zunächst Speiseröhrenbiopsieproben, die in keratinozytenserumfreies Medium (KSFM) getaucht sind. Ersetzen Sie das KSFM durch einen Milliliter Dispase I und inkubieren Sie die Biopsien 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Danach wird die Dispase mit einer 1.000-Mikroliter-Pipette aspiriert, ohne die Biopsien oder das Pellet der Zelltrümmer zu berühren.
Spülen Sie dann die Biopsien mit DPBS. Nach dem Zentrifugieren der Biopsien wird der Überstand mit einer 1.000-Mikroliter-Pipette abgesaugt. Geben Sie anschließend 500 Mikroliter Trypsin-EDTA zu den Biopsien und inkubieren Sie 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius unter Schütteln bei 800 U/min.
Führen Sie dann wiederholtes Pipettieren durch, bis eine Einzelzellsuspension erhalten wird. Mit dem Gummikolbenkopf einer Tuberkulinspritze filtrieren Sie die Zellen durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb. Waschen Sie anschließend das Sieb mit zwei bis vier Millilitern Soja-Trypsin-Hemmer.
Als nächstes filtrieren Sie die Zellen durch ein 35-Mikrometer-Zellensieb mit einer Schnappkappe auf einem Fünf-Milliliter-Polystyrolrohr mit rundem Boden. Nach dem Zentrifugieren der Zellsuspension wird der Überstand mit einer 1.000-Mikroliter-Pipette abgesaugt. Resuspendieren Sie das Zellpellet in der Hydrogel-Matrix des Basalmembranextrakts und formen Sie 40-Mikroliter-Tröpfchen in einer vorgewärmten Suspensionszellkulturplatte.
Inkubieren Sie die Platte dann ohne Medium für 20 bis 30 Minuten bei 37 Grad Celsius, um eine Verfestigung der Basalmembran-Extrakttröpfchen sicherzustellen. Fügen Sie vorgewärmtes KSFM hinzu, das mit 10 Mikromolaren Y27632 ergänzt wird. Am neunten Tag wurde die zwiebelartige mehrschichtige Struktur in einem wachsenden keratinisierten Kern im Zentrum des Organoids beobachtet.
