Entnehmen Sie zunächst differenzierte THP-1-Zellen und entfernen Sie das verbrauchte Medium aus den Vertiefungen der Kulturplatte. Geben Sie nach dem Waschen der Zellen mit PBS serumfreies Medium, das Lipopolysaccharid oder LPS enthält, zu den Zellen und inkubieren Sie die Platte. Geben Sie dann das Adenosintriphosphat oder ATP-Stammlösung in die Modellgruppe und inkubieren Sie die Platte für 45 Minuten bei 37 Grad Celsius mit 5%igem Kohlendioxid. Saugen Sie dann den gesamten Überstand aus den Vertiefungen der Kulturplatte ab.
Nachdem Sie die Zellen zweimal mit PBS gewaschen haben, geben Sie 500 Mikroliter 0,05%iges Trypsin ohne EDTA in jede Vertiefung und inkubieren Sie sie 30 Sekunden lang. Um die Zellablösung zu stoppen, fügen Sie einen Milliliter RPMI 1640 Medium hinzu und überführen Sie die Zellen in ein Fünf-Milliliter-Röhrchen. Das Röhrchen wird bei 300 g drei Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert.
Nachdem Sie die Zellen in einem Milliliter PBS resuspendiert haben, legen Sie das Röhrchen mit den Zellen drei Minuten lang in ein Wasserbad bei 37 Grad Celsius und zentrifugieren Sie. Um die Zellen wieder zu suspendieren, fügen Sie 100 Mikroliter 1X-Bindungspuffer hinzu und geben Sie die Zellen in ein neues Fünf-Milliliter-Röhrchen. Inkubieren Sie die Kontroll- und Modellröhrchen mit geeigneten Reagenzien im Dunkeln bei Raumtemperatur.
Um die Inkubation zu beenden, geben Sie 400 Mikroliter PBS in das Röhrchen und wirbeln Sie es vorsichtig ein. Filtern Sie die Zellsuspension in einem 35-Mikrometer-Nylonnetz, das an einem Fünf-Milliliter-Polystyrolrohr mit rundem Boden befestigt ist. Tauchen Sie ein sauberes Deckglas zwei Stunden lang in Chrom-Alaun-Lösung und trocknen Sie es in einem 37 Grad Celsius heißen Ofen.
Pelletieren Sie die trypsinisierten Zellen wie zuvor gezeigt und fixieren Sie die Zellen mit 500 Mikrolitern elektronenmikroskopischem Fixiermittel für zwei Stunden bei Raumtemperatur, gefolgt von einer Inkubation über Nacht bei vier Grad Celsius. Nachdem Sie die Zellen aus der fixierten Lösung gesammelt haben, pelletieren Sie sie drei Minuten lang bei 300 g bei Raumtemperatur. Fügen Sie 100 Mikroliter PBS hinzu und blasen Sie die Zellen vorsichtig weg.
Lassen Sie die Zellsuspension auf ein Deckglas fallen und lassen Sie sie fünf Minuten lang stehen. Saugen Sie den gesamten Überstand an und waschen Sie die Zellen dreimal jeweils fünf Minuten lang mit PBS. Geben Sie 500 Mikroliter 1%ige Osmischsäure-Fixierlösung hinzu.
Nach einer Stunde wird der gesamte Überstand abgesaugt. Nach drei PBS-Waschgängen dehydrieren Sie die Proben in zunehmender Ethanolkonzentration. Schalten Sie den Trockner für den kritischen Punkt ein, öffnen Sie den Kohlendioxidtank und kühlen Sie die Kammer auf 10 Grad Celsius.
Wickeln Sie die Probe schnell mit Filterpapier ein und legen Sie sie in die Kammer, wenn der Kammerdruck null Pfund pro Quadratzoll beträgt. Sobald sich die Temperatur auf 35 Grad Celsius stabilisiert hat und der Druck 1.250 Pfund pro Quadratzoll erreicht, lassen Sie den Druck bei 100 Pfund pro Quadratzoll pro Minute ab. Entnehmen Sie die Probe, wenn der Kammerdruck Null ist.
Montieren Sie die Proben schließlich mit leitfähigem Klebeband auf ein Rasterelektronenmikroskop, Aluminium-Probenhalter mit einem Sputtercodierer. Decken Sie die Proben mit einer zwei bis fünf Nanometer großen Goldschicht ab. Die Durchflusszytometrie-Analyse zeigte, dass nach LPS/ATP-Stimulation die Zellen im QT-Bereich signifikant zunahmen, was auf den Zelltod hindeutet.
Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen der Plasmamembranoberfläche zeigten Merkmale der Pyroptose, einschließlich Membranblasen und -ruptur bei LPS/ATP-stimulierten Zellen, während die Kontrollzellen normal aussahen. Darüber hinaus führte die LPS/ATP-Stimulation zum Auftreten apoptotischer Eigenschaften in den Zellen wie Membranblasen und Zellschrumpfung, und Zellen mit Nekroptosemerkmalen wie Zellschwellung und geplatzter Membran wurden beobachtet.
