Nachdem Sie Gametenbündel von hermaphroditischen und Spermien von gonochorischen Korallenarten gesammelt haben, legen Sie sie in beschriftete 50-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie vier Mikroliter aktivierte Spermiensuspension auf eine Makler-Zählkammer. Um die Beweglichkeit der Spermien zu beurteilen, fügen Sie die Konzentration der aktivierten Probe hinzu.
Öffnen Sie die Datei mit dem automatischen Datenblatt des Korallenbiobankings und geben Sie den Spermienverdünnungsfaktor ein, der für die computergestützte Spermienanalyse verwendet wird. Geben Sie dann die computergestützten Spermienanalyseergebnisse für die Spermienkonzentration, die Gesamtmotilität und die progressive Motilität ein. Schreiben Sie die Spermienkonzentration auf das gefilterte Samenprobenröhrchen und übertragen Sie das Röhrchen in den Kryokonservierungsarbeitsplatz.
Öffnen Sie das Auto-Datenblatt für das freigegebene Korallen-Biobanking und wählen Sie die Registerkarte Kryokonservierung. Nachdem Sie das Etikett des Samenprobenahmeröhrchens überprüft haben, identifizieren Sie den entsprechenden Eintrag, indem Sie die Kolonie-ID überprüfen.Messen Sie mit einer serologischen Pipette das Volumen der Samenprobe, indem Sie sie in dasselbe Röhrchen ziehen und wieder ausstoßen. Geben Sie den Wert in Spalte E ein.Überprüfen Sie die automatisch berechnete Spalte 1 für die erforderliche Kryoprotektivmittelkonzentration und Spalte H für das hinzuzufügende Kryoverdünnungsmittelvolumen.
Starten Sie einen Timer. Und fügen Sie mit einer Pipette tropfenweise das Kryoverdünnungsmittel DMSO hinzu, wobei Sie die Probe ständig sanft mischen. Notieren Sie den Zeitpunkt der Kryoverdünner-Ausgabe in Spalte P.Lesen Sie Spalte K, um die Anzahl der zu befüllenden Kryofläschchen zu bestimmen.
Entschließen Sie sterile Kryo-Fläschchen mit Barcode und ordnen Sie die Kappen auf einer sterilen Oberfläche an. Aliquotieren Sie mit einer serologischen Pipette und einer aliquotierenden Pipette einen Milliliter Proben in barcodierte Kryofläschchen und Recap-Fläschchen. Legen Sie ein Thermoelement-Fläschchen und alle gefüllten Probenfläschchen bei Raumtemperatur in einen leeren Kryo-Rackeinsatz.
Legen Sie dann die Dummy-Kryofläschchen mit 10 % DMSO in gefiltertem Meerwasser in leere Schlitze auf dem Kryo-Rack. Geben Sie die Laufnummer in Spalte U des Auto-Datenblatts ein und scannen Sie die Seriennummer des Kryo-Racks in Spalte V.Platzieren Sie den Cursor in der richtigen Zelle von Spalte Z und scannen Sie das Thermoelement-Fläschchen, gefolgt von allen Kryo-Fläschchenröhrchen. Stellen Sie beladene und gescannte Racks für den Rest des Kryoprotektivmittel-Gleichgewichts beiseite.
Füllen Sie das Kühlgefäß des Kryo-Racks mit flüssigem Stickstoff auf das für eine Kühlung erforderliche Niveau von ca. 20 Grad Celsius pro Minute. Schließen Sie nach Ablauf der 10-minütigen Gleichgewichtsphase des Kryoprotektivums die Thermoelementsonde an den Datenlogger an und beginnen Sie mit der Aufzeichnung. Setzen Sie das volle Kryo-Rack vorsichtig in das Kühlgefäß ein und setzen Sie den Deckel auf.
Notieren Sie die Startzeit in Spalte Q. Sobald das Thermoelementfläschchen auf dem Datenlogger 80 Grad Celsius oder weniger anzeigt, überführen Sie den Kryo-Rack-Einsatz in ein Flüssigstickstoffbad, um die Proben abzuschrecken. Nehmen Sie die Kryo-Fläschchen aus dem Gestell und übergeben Sie sie für den Transport zur Biobank an einen Trockenversender. Bei Acropora millepora zeigten die Objektträger der festen Deckglaskammer weniger als die Hälfte der Spermienkonzentrationszahlen im Vergleich zur Makler-Zählkammer.
Die Validierung der Makler-Zählkammer mit kommerziell erhältlichen Latex-Mikrokügelchen in einer bekannten Konzentration führte zu konsistenten Zählungen mit geringer Variabilität innerhalb des erwarteten Bereichs. Es wurde kein signifikanter Unterschied in den Konzentrationen von gesamten, beweglichen oder progressiv beweglichen Spermien nach dem Auftauen in Proben beobachtet, die mit 20 % oder 30 % DMSO als Kryoverdünnungsmittel kryokonserviert wurden.
