Pipettieren Sie zunächst 20 Mikroliter Tröpfchen Peptid-Hydrogel in eine 24-Well-Platte. Satieren Sie 800 Zellen aus der SW1222-Zelllinie vier Tage lang in jede Vertiefung. Pipettieren Sie das Medium am vierten Tag heraus.
Waschen Sie jedes Mal gut mit PBS. Geben Sie dann 400 Mikroliter 4%ige Formaldehydlösung in die Vertiefungen. Sobald die Inkubation abgeschlossen ist, verwenden Sie eine P1000-Pipettenspitze, um die Formaldehydlösung abzusaugen.
Waschen Sie dann die Vertiefungen erneut mit PBS. Inkubieren Sie die Zellen in einem Milliliter Permeabilisierungspuffer für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Nachdem Sie den Puffer herauspipettiert und die Vertiefungen mit PBS gewaschen haben, fügen Sie 0,5 Milliliter Blockierungspuffer hinzu.
Waschen Sie nun die Vertiefungen mit PBS, nachdem Sie den Blockierungspuffer entfernt haben. Pipettieren Sie dann 200 Mikroliter des verdünnten Primärantikörpers in die Vertiefungen. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei vier Grad Celsius.
Entfernen Sie die Lösung mit einer P200-Pipettenspitze. Waschen Sie dann die Vertiefungen mit PBS-Lösung. Als nächstes geben Sie das Phalloidin-Konjugat in ein Fläschchen mit verdünntem Sekundärantikörper im Verhältnis eins zu 40.
Pipettieren Sie diese Mischung in die Vertiefungen der Platte. Inkubieren Sie die Platte dann drei Stunden lang bei Raumtemperatur im Dunkeln. Nachdem Sie die Lösung abgesaugt und die Vertiefungen mit PBS gewaschen haben, pipettieren Sie 300 Mikroliter DAPI-Lösung in jede Vertiefung.
Waschen Sie die Vertiefungen nach der Inkubation erneut mit PBS, nachdem Sie die Lösung herauspipettiert haben. Lagern Sie die Platte bis zu sieben Tage bei vier Grad Celsius. Die Immunfärbung zeigte, dass die Organoide, die im nicht-biofunktionellen Peptid P, im biofunktionalisierten Peptid P1 und im Matrigel gefunden wurden, in den apikalen und basolateralen Membranen lokalisiert waren.
Das nicht-biofunktionelle Peptid P induzierte die Expression von Zell-Zell-Verbindungen in der basolateralen Membran.
