Kontinuierliche Gradientenmethode für die Reinigung von Schweineinseln

Stellen Sie zunächst eine Pumpe auf eine Durchflussrate von 200 Millilitern pro Minute ein und laden Sie 125 Milliliter Gradientenlösung mit hoher Dichte in den kontinuierlichen Gradientenformer und dann in den Zellprozessor. Starten Sie die Zentrifugenfunktion des Zellprozessors bei 1.000 U/min. Lassen Sie Luft aus dem System ab und repräsentieren Sie sie mit einer Gradientenlösung mit hoher Dichte.

Geben Sie dann 125 Milliliter Gradientenlösung mit hoher Dichte und 130 Milliliter Lösung mit niedriger Dichte in den Gradientenbildner. Laden Sie 100 Milliliter verdaute Gewebesuspension. Erhöhen Sie die Prozessorgeschwindigkeit der Zelle drei Minuten lang auf 2.000 U/min.

Zur Herstellung von 16 konischen Röhrchen mit einem Fassungsvermögen von 50 Millilitern zum Auffangen der gereinigten Inselfraktion werden 25 Milliliter RPMI-Medium in jedes Röhrchen gegeben und in aufsteigender Reihenfolge angeordnet. Sammeln Sie die gereinigten Inselfraktionen in den vorbereiteten konischen Röhrchen. Um die Inselzellen zu färben, sammeln Sie 100 bis 200 Mikroliter Aliquots von jeder gereinigten Inselfraktion und bestimmen Sie den Inselgehalt mithilfe der DTZ-Färbung in einer 24-Well-Gewebekulturplatte.

Untersuchen Sie jede Fraktion mit Lichtmikroskopie bei 4X, wobei die Inselzellen dunkelrot bis schwarz erscheinen. Unter Verwendung dieses Protokolls wurde die Isolierung der Pankreasinsel an drei Schweinen durchgeführt. Hellfeldbilder zeigten gereinigte Pankreasinseln, die mittels Lebend-/Totfärbung auf Lebensfähigkeit charakterisiert wurden.

Die repräsentative Größenverteilung der Inselzellen nach der Isolierung der Inselzellen zeigte eine Größenverteilung von etwa 50 bis 100 Mikrometern. Darüber hinaus wurden Ausbeute und Reinheit mit einem Inselzellzähler bewertet, was auf eine effiziente Isolierung der Bauchspeicheldrüse von Schweinen hinweist.