Um mit der Färbung der fixierten Netzhaut-Organoide (ROs) für die Transmissionselektronenmikroskopie zu beginnen, verwenden Sie eine Pipette, um die Osmiumsäure zu entfernen, die zuvor den Organoiden im Mikrozentrifugenröhrchen während der Nachfixierung zugesetzt wurde. Waschen Sie dann die ROs dreimal für jeweils 10 Minuten mit 0,01 molaren PBS bei pH 7,4, gefolgt von einem dreimal für 10 Minuten mit deionisiertem Wasser. Entfernen Sie die letzte Wäsche mit entionisiertem Wasser, ersetzen Sie sie durch etwa 150 Mikroliter Uranacetat und färben Sie sie ein bis zwei Stunden lang bei Raumtemperatur.
Entfernen Sie anschließend in einem Abzug das Uranacetat und ersetzen Sie es durch einen Milliliter 50%iges Aceton, um die Proben 10 Minuten lang zu dehydrieren. Führen Sie dann eine Gradientendehydrierung mit 70 %, 80 %, 90 % und zweimal 100 % Aceton nacheinander durch, jeweils 10 Minuten lang. Nach der Gradientendehydratisierung wird das restliche Aceton verworfen und ca. 150 Mikroliter einer Mischung aus Aceton und Epon-812-Harz hinzugefügt.
Stellen Sie die Tube für eine Stunde in einen 37 Grad Celsius heißen Ofen. Nachdem Sie das vorherige Aceton-Harz-Gemisch entfernt haben, ersetzen Sie es durch eine andere Zusammensetzung aus Aceton und Epon-812-Harzmischung. Dieses Mal inkubieren Sie das Röhrchen über Nacht bei 37 Grad Celsius.
Zum Schluss werden die Netzhautorganoide vorsichtig in ein neues Röhrchen mit ca. 500 Mikrolitern reinem Epoxidharz überführt. Und inkubieren Sie eine Stunde lang bei 45 Grad Celsius, bevor Sie mit der Einbettung von Organoiden fortfahren.
