Stellen Sie zunächst ein 70-Mikrometer-Sieb auf ein Fünf-Milliliter-Polypropylen-Röhrchen. Pipettieren Sie 500 Mikroliter des Nervenzellmediums darüber. Übertragen Sie das dissoziierte Maus-Hippocampus-Gewebehomogenat durch das Sieb in das Röhrchen.
Pipettieren Sie dann zweimal einen Milliliter kaltes Nervenzellmedium über den Homogenisator, um ihn zu spülen. Fügen Sie nun 500 Mikroliter eiskaltes DPBS zum Pellet hinzu, um es wieder zu suspendieren. Füllen Sie das Volumen der Suspension mit DPBS auf 1,5 Milliliter auf.
Pipettieren Sie 500 Mikroliter isotonische Percoll-Lösung in die Probe. Überlagern Sie die Lösung mit zwei Millilitern kaltem DPBS in der Zentrifuge. Anschließend aspirieren Sie in der mittleren Phase die Deckschicht und die Myelinscheibe.
Geben Sie dann vier Milliliter kaltes DPBS in das Röhrchen und saugen Sie den Überstand nach dem Zentrifugieren an. Anschließend werden die Zellen in 100 Mikrolitern fixierbarer Viabilitätsfärbelösung resuspendiert. Pipettieren Sie einen Milliliter kaltes DPBS in die Probe, bevor Sie die Probe fünf Minuten lang bei 300 x g zentrifugieren.
Nach dem Aspirieren des Überstands werden 100 Mikroliter CD16, CD32-Färbelösung zugegeben. Wirbeln Sie die Probe fünf Sekunden lang vor und inkubieren Sie sie dann. Nach der Inkubation geben Sie einen Milliliter FACS-Puffer in die Probe und zentrifugieren Sie.
Pipettieren Sie 100 Mikroliter des Färbemastermixes in das Röhrchen. Anschließend werden die Proben 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius im Dunkeln inkubiert. Geben Sie nun einen Milliliter FACS-Puffer in die Probe, bevor Sie wie zuvor zentrifugieren.
Das Pellet wird in 250 Mikrolitern Fixierpuffer resuspendiert, nachdem der Überstand entsorgt wurde. Geben Sie anschließend zwei Milliliter Permeabilisierungspuffer in das Röhrchen und zentrifugieren Sie erneut. Pipettieren Sie 100 Mikroliter vGLUT1 Färbelösung in das Pellet.
Dann wirbeln Sie die Mischung etwa fünf Sekunden lang vor der Inkubation und Zentrifugation ein. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 250 Mikrolitern FACS-Puffer. Zum Schluss filtrieren Sie die Proben durch einen 40-Mikrometer-Filter.
Ein höheres vGLUT1-PE-Fluoreszenzsignal wurde von den hippokampalen Mikroglia im Vergleich zur Isotypkontrolle beobachtet. Ein höheres vGLUT1-PE-Fluoreszenzsignal wurde in den Mikroglia des Riechkolbens und ein niedrigeres Signal im Kleinhirn im Vergleich zum Hippocampus gefunden. Die geringste Signalintensität wurde in den Milzmakrophagen nachgewiesen.
