Zu Beginn inkubieren Sie ein Röhrchen mit dissoziiertem Hippocampusgewebe der Maus 20 Minuten lang in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius. Übertragen Sie die Suspension der trüben Zellen in ein neues 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Nach dem Verwerfen des Überstands wird das Zellpellet in fünf Millilitern der Waschmischlösung resuspendiert.
Geben Sie die Probe anschließend durch einen 70-Mikrometer-Filter in ein Fünf-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, bevor Sie erneut zentrifugieren. Die Probe wird einer Percoll-Gradientenzentrifugation unterzogen, dann das Zellpellet in 100 Mikrolitern MACS-Färbepuffer resuspendiert und inkubiert. Pipettieren Sie nun vor dem Zentrifugieren einen Milliliter MACS-Puffer in die Probe.
Suspendieren Sie dann das Zellpellet in 500 Mikrolitern MACS-Puffer. Spülen Sie anschließend die positiven Selektionssäulen eines Magnetabscheiders mit drei Millilitern MACS-Puffer. Tragen Sie vorsichtig 500 Mikroliter der Zellsuspension auf eine Säule auf.
Nachdem Sie die Säulen dreimal mit MACS-Puffer gewaschen haben, legen Sie die Säulen auf konische 15-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie fünf Milliliter MACS-Puffer in die Spalte. Als nächstes zentrifugieren Sie die Proben bei 300 g für 10 Minuten und fügen Sie dann einen Milliliter vorgewärmtes DMEM zum Pellet hinzu.
Übertragen Sie 500 Mikroliter der endgültigen Zellsuspension in die Vertiefungen einer 24-Well-Platte. Ersetzen Sie 250 Mikroliter jeder Vertiefung durch frisches, vorgewärmtes DMEM. Geben Sie dann drei Mikrogramm pHrodo Red-markierte Synaptosomen über das Medium.
Fügen Sie den Negativkontrollen das gleiche Volumen an unmarkierten Synaptosomen hinzu. Waschen Sie die Vertiefungen nach der Inkubation mit kaltem DPBS. Pipettieren Sie nun 200 Mikroliter Trypsin-EDTA in jede Vertiefung.
Nach einer 35-sekündigen Inkubation pipettieren Sie einen Milliliter DPBS, das FBS enthält, in jede Vertiefung. Übertragen Sie die Zellsuspension durch ein Sieb in ein Fünf-Milliliter-Polypropylen-Röhrchen und waschen Sie jede Vertiefung zweimal mit 500 Mikrolitern eiskaltem DPBS. Zentrifugieren Sie die entnommenen Proben bei 500 g für fünf Minuten.
Anschließend inkubieren Sie die Zellen in 100 Mikrolitern der Färbelösung für 10 Minuten auf Eis. Fügen Sie dann CD11b und CD45 zur Färbelösung hinzu, um eine Endkonzentration von 1 bis 100 zu erreichen. Inkubieren Sie die Proben bei vier Grad Celsius für 20 Minuten im Dunkeln.
Pipettieren Sie einen Milliliter FACS-Puffer in die Probe und unterziehen Sie sie dann 10 Minuten lang einer abschließenden Zentrifugation bei 300 g, bevor Sie die durchflusszytometrische Analyse durchführen. Eine positive PE-Fluoreszenz, die mit der von Synaptosomen bei pH 4 vergleichbar ist, wurde bei CD11b-positiven und CD45-positiven Mikroglia beobachtet.
