Zu Beginn resuspendieren Sie die Skelettmuskelzellen, die von Notexin-verletzten Mäusen isoliert wurden, die mit Joddesoxyuridin in einem Milliliter kaltem serumfreiem DMEM markiert wurden, und zählen Sie sie mit einem Hämozytometer oder einem Zellzähler. Unter einem Abzug wird Cisplatin zugegeben, um eine Endkonzentration von 25 Mikromolar zu erreichen. Wirbeln Sie das Röhrchen 10 Sekunden lang vor und inkubieren Sie es eine Minute lang bei Raumtemperatur.
Quaktieren Sie die Reaktion mit eiskaltem DMEM mit 10% FBS ab und legen Sie es auf Eis. Nach dem Pelletieren und Resuspendieren der Zellen wird die Suspension durch ein 35-Mikrometer-Zellensieb filtriert. Geben Sie unter einem Abzug gefilterte Paraformaldehyd-Stammlösung, um die Zellsuspension und den Wirbel 30 Sekunden lang zu fixieren.
Waschen Sie es zweimal mit zwei Millilitern Zellfärbemedium oder CSM durch Zentrifugation. Nach der letzten Wäsche den Überstand auf ca. 60 Mikroliter ansaugen und das Pellet gründlich resuspendieren. Fügen Sie 40 Mikroliter der in CSM hergestellten 2,5-fachen Oberflächenantikörper-Färbemischung hinzu und inkubieren Sie sie eine Stunde lang, während sie alle 20 Minuten vortexen.
Nachdem Sie die Probe zweimal mit CSM gewaschen haben, aspirieren Sie den Überstand und schnippen Sie das Pellet. Um die Zellen zu permeabilisieren, fügen Sie unter einem Abzug 0,5 Milliliter eiskaltes Methanol tropfenweise hinzu, während Sie es vortexen. Waschen Sie die Zellen zweimal mit einem Milliliter CSM durch Zentrifugation.
Nach der letzten Wäsche den Überstand auf ca. 60 Mikroliter ansaugen und das Pellet gründlich resuspendieren. Inkubieren Sie die Zellen eine Stunde lang mit 40 Mikrolitern intrazellulärer Antikörper-Färbemischung, während die Proben alle 20 Minuten vortexen. Nachdem Sie die Zellen zweimal mit einem Milliliter CSM gewaschen haben, resuspendieren Sie die Proben in 0,5 Millilitern der Interkalator-Iridiumlösung und wirbeln Sie sie auf.
