Nehmen Sie zunächst die mit Cisplatin, metallkonjugierten Antikörpern und Interkalator-Iridium-Lösung gefärbten Skelettmuskelzellen und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation. Sobald der Überstand entfernt ist, fügen Sie den verwirbelten Zellen einen Milliliter CSM hinzu. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation und waschen Sie einen Milliliter CAS-Puffer ein.
Nach der Zentrifugation wird der Überstand auf etwa 200 Mikroliter abgesaugt. Geben Sie einen Milliliter CAS-Puffer zu den vortexierten Proben und aliquotieren Sie fünf Mikroliter für die Zellzahl. Nach dem Zentrifugieren der Zellen und dem Ansaugen des Überstands auf 50 Mikroliter resuspendieren Sie die Zellen in CAS-Puffer auf eine Endkonzentration von 1 Million Zellen pro Milliliter und fügen Sie Kalibrierkügelchen hinzu, um eine Endkonzentration von 0,1x zu erreichen.
Laden Sie die Probe in das Massenzytometer, um Daten mit einer Flussrate von 400 bis 500 Zellen pro Sekunde zu sammeln, und normalisieren Sie die Daten nach der Entnahme. Verketten Sie bei Bedarf einzelne Durchflusszytometrie-Standard- oder FCS-Dateien für jede Probe in einer einzigen Datei. Identifizieren Sie einzelne Zellen durch Gating bei positiven Ereignissen des Iridium-Interkalators.
Wählen Sie Ereignisse aus, die für Cisplatin zum Gate für lebende Zellen negativ sind. Bestimmen Sie die interessierende Population und quantifizieren Sie den relativen Anteil von Stamm- und Vorläuferzellen. Um eine hochdimensionale Analyse durchzuführen, exportieren Sie die interessierende Grundgesamtheit, und verwenden Sie Clustering-Algorithmen.
Für die X-Shift-Analyse laden Sie das Vortex-Softwarepaket und Java 64-Bit herunter. Laden Sie die exportierten Zellpopulationen in eine lokale Datenbank hoch und definieren Sie die Clustering-Parameter. Um die räumlichen Beziehungen zwischen Zellpopulationen innerhalb der X-Shift-Cluster zu visualisieren, führen Sie ein kraftgesteuertes Layout aus.
Die CyTOF-Analyse identifizierte eine Sequenz von vier Populationen, Stammzellen und Vorläuferpopulationen von eins bis drei. Die Vorläuferpopulationen P1 und P2 entsprechen zunehmend reiferen Vorläuferzellen. P3 wurde zuvor identifiziert, aber aufgrund seiner geringen Abundanz nicht charakterisiert.
Die Dynamik der Stamm- und Vorläuferzellen nach der Verletzung wurde anhand von CD9 x CD104 mittels axialer Punktdiagramme analysiert. Am dritten Tag wurde ein bemerkenswerter Anstieg der Stammzellpopulation beobachtet, was auf eine Expansion hindeutet. Dies wurde durch einen erhöhten Joddesoxyuridin-Einbau unterstützt, der auf eine Zellproliferation hinweist, und eine erhöhte MyoD-Expression, wie durch das Farb-Overlay gezeigt.
Aktivierte Stammzellen, die durch hohe Spiegel von CD98, CD44, MyoD und Joddesoxyuridin gekennzeichnet waren, wurden identifiziert, was ihre hohe Proliferation und ihren aktivierten Zustand am dritten Tag nach der Verletzung unterstreicht.
