Sprühen Sie zunächst die Maushaut mit 70%igem Ethanol ein. Öffnen Sie dann mit einer sterilen Präparierschere die Haut und legen Sie den Beinmuskel frei. Schneiden Sie den Muskel entlang des Beins ab, um den Knochen klar zu sehen, und entfernen Sie den Knochen sanft, ohne ihn zu beschädigen.
Legen Sie den Knochen sofort in ein Röhrchen mit 4 % Paraldehyd und legen Sie das Röhrchen auf Eis. Nachdem Sie alle Knochenproben entnommen haben, legen Sie die Röhrchen mindestens 24 Stunden lang bei vier Grad Celsius in einem kalten Raum auf einen Orbitalschüttler. Nach der Fixierung das Knochengewebe aus dem Orbitalschüttler entnehmen und zweimal für jeweils drei Minuten mit 1X PBS waschen.
Verwenden Sie dann eine sterile Präparierschere, um alle verbleibenden Muskeln zu entfernen, die am Knochen befestigt sind. Waschen Sie den Knochen erneut drei Minuten lang mit 1X PBS. Legen Sie den Knochen in einen neuen Behälter mit 20 %DDTA bei pH acht und inkubieren Sie ihn 30 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 140 U/min auf einem Orbitalschüttler.
Ersetzen Sie dann die EDTA-Lösung durch frisches 20%iges DDTA und wiederholen Sie das Rühren für weitere 30 Minuten. Nach der abschließenden EDTA-Behandlung frisches EDTA hinzufügen und den Behälter über Nacht bei vier Grad Celsius auf einem Orbitalschüttler inkubieren. Nehmen Sie anschließend die Proben aus dem EDTA-Behälter und waschen Sie sie zweimal mit 1X PBS, um EDTA-Rückstände zu entfernen.
Initiieren Sie den Dehydratisierungsprozess, indem Sie den Knochen in 70%iges Ethanol legen und 15 Minuten lang bei 140 U/min inkubieren. Verwerfen Sie dann die 70%ige Ethanollösung und fügen Sie 90%ige Ethanollösung hinzu. 15 Minuten bei 140 U/min inkubieren.
Leiten Sie als Nächstes den Reinigungsprozess ein, indem Sie das dehydrierte Knochengewebe in einen neuen Behälter mit Xylol geben. 20 Minuten bei 140 U/min inkubieren. Ersetzen Sie das verwendete Xylol durch frisches Xylol und inkubieren Sie es weitere 20 Minuten.
Legen Sie als Nächstes die gereinigte Knochenprobe in eine Einbettkassette und beginnen Sie mit der Wachsinfiltration. 30 Minuten bei 60 Grad Celsius inkubieren. Entsorgen Sie das gebrauchte Wachs, fügen Sie neues Wachs hinzu und inkubieren Sie weitere 30 Minuten.
Ersetzen Sie dann das Wachs und inkubieren Sie weitere 45 Minuten. Positionieren Sie den Knochen vorsichtig in einer Form in der gewünschten Ausrichtung. Lassen Sie das Wachs auf einer kalten Oberfläche erstarren.
Lagern Sie den Block bis zum Schneiden bei vier Grad Celsius. Bereiten Sie als Nächstes das Gerät für das Trennen vor. Besprühen Sie alle Arbeitsflächen und Instrumente mit dekontaminierenden Lösungen, um RNasen zu entfernen.
Stellen Sie außerdem ein Wasserbad mit doppelt destilliertem Wasser bei 42 Grad Celsius auf. Reinigen Sie eine Mikrotomklinge mit 70 % Ethanol, um Öl zu entfernen, und dekontaminieren Sie sie dann, um RNasen zu entfernen. Befestigen Sie die Klinge auf dem Mikrotom und stellen Sie sicher, dass der Abstandswinkel auf 10 Grad eingestellt ist.
Besprühen Sie Pinzetten, Bürsten und Sonden mit dekontaminierenden Lösungen und bewahren Sie sie in einem Eiskübel auf. Bereiten Sie ein Eisbad vor, indem Sie doppelt destilliertes Wasser in einen anderen Eiskübel geben. Starten Sie den Schnittvorgang, indem Sie den FFPE-Block auf das Mikrotom legen.
Stellen Sie das Mikrotom auf Trimmen ein oder stellen Sie eine Scrolldicke von 14 Mikrometern ein. Beginnen Sie mit dem Trimmen der Probe und fahren Sie fort, bis das Gewebe sichtbar ist. Hydratisieren Sie den FFPE-Block, indem Sie ihn auf ein Eisbad legen.
Befestigen Sie die hydratisierte Probe in der Mikrotom-Probenklemme, richten Sie sie mit der Klinge aus und stellen Sie die Scrolldicke auf fünf Mikrometer ein. Beginnen Sie mit dem Schneiden des Gewebes. Sammeln Sie das geschnittene Gewebe mit einer kalten Pinzette und Bürste und legen Sie es in ein 42 Grad Celsius heißes Wasserbad.
Legen Sie das Gewebe auf einen Objektträger und inkubieren Sie es drei Stunden lang bei 42 Grad Celsius. Trocknen Sie die Rutsche über Nacht im Ofen bei Raumtemperatur. Lagern Sie den vorbereiteten Objektträger in einer Objektträgerbox bei Raumtemperatur.
Mit dieser Methode wurden demineralisierte FFPE-Knochenproben aus spiegelnden Oberschenkelknochen hergestellt. Der Entkalkungszeitverlauf wurde durch den Vergleich von unverkalkten Femuren mit denen, die drei und 24 Stunden lang entkalkt wurden, optimiert. Die H- und E-Färbung zeigte, dass eine kürzere Entkalkungszeit zu Frakturen und Schädigungen in den Schnitten führte, während der 24-Stunden-Prozess zu einer überlegenen histologischen Qualität führte.
Die Bewertung der RNA-Qualität anhand des RNA-Fragmentverteilungswerts DV200 ergab, dass entkalkte Proben DV200-Werte von über 50 % beibehielten, die für Analysen wie SCRNAC oder Spatial Transcriptomics geeignet sind. Verlängerte Inkubationszeiten führten jedoch zu einer Abnahme der RNA-Integrität und werden daher nicht empfohlen.
