Zu Beginn tauen Sie Thrombin und Aprotinin auf Eis auf und stellen Sie ein Fibrinogenfläschchen in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad. Homogenisieren Sie sie mit einer Pipette unter der Haube. Setzen Sie dann die Einsätze mit einer sterilen Zange in die Kulturvertiefungen ein und lassen Sie mindestens eine Spalte oder Reihe auf der Platte leer.
Geben Sie zunächst die erforderlichen Mengen an Fibrinogen und Aprotinin in ein 0,25-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie dann das Thrombin in die Tube und spülen Sie es zweimal schnell, ohne Blasen zu bilden. Zeichne den gesamten Inhalt der Tube.
Positionieren Sie die Pipette senkrecht über der Mitte des Einsatzes und spülen Sie eine Reagenzmischung vorsichtig aus, ohne Blasen zu erzeugen. Mindestens eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubieren, bis die Mischung undurchsichtig weiß wird. Für die Aussaat von Organoiden bestätigen Sie unter dem Mikroskop, dass die Mikromassen kugelförmige Zellmassen bilden, mit einem kompakten Chorus, der von einem Halo mit geringerer Dichte aus frühen Thymusvorläuferzellen umgeben ist.
Schneiden Sie die Spitze eines P200-Kegels ab und waschen Sie ihn mit einer antihaftenden Lösung. Kippen Sie die Platte in eine nahezu vertikale Position und saugen Sie die Zellmassen vom Boden der Vertiefung an. Tragen Sie die Masse vorsichtig an der Oberseite der Hydrogele auf, ohne das Gel zu berühren.
Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob sich kein Organoid mehr in den Plattenvertiefungen befindet. Geben Sie dann langsam ein Viertel des Volumens des Kulturmediums an der Oberseite des Hydrogels hinzu, ohne es zu berühren, und fügen Sie die restlichen 3/4 am Boden der Vertiefung hinzu. Geben Sie einen Milliliter PBS in die leeren Kulturvertiefungen, um die Luftfeuchtigkeit in der Platte aufrechtzuerhalten, und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid.
Die Organoide bilden kugelförmige bis längliche Strukturen und verschmelzen gelegentlich zu größeren Strukturen in den Hydrogelen.
