Nach der Erzeugung einer Wasserstoffperoxid-induzierten MCF-7-Zellkultur ist der Überstand aus der Kulturschale zu entsorgen. Fügen Sie einen Milliliter PBS hinzu und schütteln Sie das Gericht vorsichtig, bevor Sie das PBS wegwerfen. Fügen Sie nun einen Milliliter Trypsin hinzu, um die Zellen zu waschen, schütteln Sie die Schale und warten Sie eine Minute, dann entsorgen Sie Trypsin.
Klopfen Sie vorsichtig auf die Schale, beobachten Sie die Zellbewegung im Blatt, um die Ablösung zu bestätigen. Fügen Sie dann vier Milliliter vollständiges Kulturmedium hinzu und geben Sie die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Die Suspension wird fünf Minuten lang bei 800 g zentrifugiert und der Überstand entfernt.
Fügen Sie 200 Mikroliter PBS hinzu, um das Pellet zu resuspendieren, und übertragen Sie die Zellsuspension in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Führen Sie danach wiederholte Gefrier-Tau-Zyklen durch, um die Zellen zu zerstören. Zentrifugieren Sie das Zelllysat 10 Minuten lang bei 1500 g und sammeln Sie den Überstand für die Analyse.
Tauen Sie ELISA-Reagenzien vor Beginn des Assays 20 Minuten lang bei Raumtemperatur auf und heizen Sie den ELISA-Reader 15 Minuten vor der Verwendung vor. Verdünnen Sie den erforderlichen 20-fach konzentrierten Waschpuffer mit deionisiertem Wasser zu einer Arbeitslösung. Bereiten Sie Arbeitslösungen von Standardproben vor und mischen Sie diese vorsichtig auf und ab, ohne dass sich Blasen bilden.
50 Mikroliter Standard-Arbeitslösung und Nachweisproben mit unterschiedlichen Konzentrationen werden in die Reaktionsvertiefungen gegeben, mit Ausnahme von Blindvertiefungen, und 100 Mikroliter Meerrettichperoxidase-konjugierten Nachweisantikörper in jede Reaktionsvertiefung gegeben. Verschließen Sie die Vertiefungen mit einer Plattendichtung und inkubieren Sie sie 60 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie nach der Inkubation die Antikörperlösung.
Die restliche Flüssigkeit in den Vertiefungen abschütteln und auf saugfähigem Papier trocken tupfen. Geben Sie 350 Mikroliter Waschpuffer in jede Reaktionsvertiefung. Verwerfen Sie den Puffer nach ein bis zwei Minuten, bevor Sie 50 Mikroliter der Substrate A und B zu jeder Reaktionsvertiefung hinzufügen.
Verschließen Sie die Platte und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius im Dunkeln. Geben Sie nach 15 Minuten 50 Mikroliter Stopplösung in jede Reaktionsvertiefung. Messen Sie sofort den Wert der optischen Dichte bei einer Wellenlänge von 450 Nanometern mit einem ELISA-Reader.
Die Wirkung von Wasserstoffperoxid auf die Lebensfähigkeit von MCF-7-Zellen zeigte, dass eine Behandlung mit 0,75 Millimolar für 12 Stunden die Lebensfähigkeit auf 67 % reduzierteBei einer höheren Konzentration von 1,5 Millimolar sank die Zellviabilität drastisch auf unter 3 %MCF-7-Zellen nach steigender Konzentration von Wasserstoffperoxid Die Behandlung zeigte erhöhte Spiegel von 8-Oxo-dG, was den Einfluss von oxidativem Stress auf DNA-Schäden verdeutlicht.
