Zu Beginn besorgen Sie sich eine sechs bis acht Wochen alte CD 45.1-positive SMARTA-Maus und injizieren Sie ihr intravenös 200 Mikrogramm LCMV GP 61-77 Peptid in 100 Mikroliter RPMI-Medium. Nachdem Sie die Splenozyten aus der Maus gewonnen haben, suspendieren Sie sie in 2%RPMI, um eine Zelldichte von eins mal 10 zu den eighT-Zellen pro Milliliter zu erreichen, und legen Sie das Röhrchen mit den Zellen auf Eis. Geben Sie 50 Mikroliter Zellsuspension zusammen mit 150 Mikrolitern Färbepuffer in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit rundem Boden.
Die 96-Well-Platte wird eine Minute lang bei 800 g bei vier Grad Celsius zentrifugiert und der Überstand vorsichtig dekantiert. Wirbeln Sie die Platte vor und geben Sie 200 Mikroliter Färbepuffer in jede Vertiefung. Nach dem Pelletieren der Zellen resuspendieren und inkubieren Sie sie mit einem Oberflächenantikörpercocktail auf Eis für 30 Minuten im Dunkeln.
Nach zweimaligem Waschen resuspendieren Sie die Zellen in 200 Mikrolitern Färbepuffer und überführen sie in ein Durchflusszytometrieröhrchen. Führen Sie eine Durchflusszytometrie-Analyse durch, um den Aktivierungsstatus von SMARTA CD4-positiven T-Zellen zu überprüfen. Dann säen Sie die sechs SMARTA CD4-positiven T-Zellen pro Well einmal mal 10 in eine 24-Well-Platte.
Schleudern Sie die Zellen bei 800 g drei Minuten lang bei vier Grad Celsius herunter und entfernen Sie vorsichtig den Überstand. Geben Sie als Nächstes einen Milliliter Retrovirusmedium und acht Mikrogramm Polybren in jede Vertiefung. Schleudern Sie die Zellen bei 800 G für zwei Stunden bei 37 Grad Celsius.
Nach dem Verwerfen des Retrovirus-Mediums inkubieren Sie die Zellen mit einem Milliliter vorgewärmtem 10%RPMI, das mit Interleukin 2 ergänzt wurde. Füllen Sie die Zellsuspension in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie es. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, resuspendieren Sie die Zellen mit 2 %RPMI, um eine Zelldichte von eins mal 10 bis zu den achten Zellen pro Milliliter zu erreichen.
Zur Beurteilung der Transduktionseffizienz aliquotieren Sie 50 Mikroliter Zellsuspension in eine 96-Well-Platte mit rundem Boden. Inkubieren Sie sie auf Eis mit dem Oberflächen-Antikörper-Cocktail bestehend aus CD4, V alpha zwei und Vektor-Tag-assoziiertem Antikörper. Waschen Sie die Zellen und führen Sie die Durchflusszytometrie durch, wie bereits gezeigt.
Injizieren Sie dann einmal 10 der sechs CD 45.1 positiven SMARTA CD4 T-Zellen intravenös in eine C57BL/6 Empfängermaus, gefolgt von einer mal 10 in die sechs plaquebildenden Einheiten von LCMV Armstrong am nächsten Tag. Nachdem Sie die Splenozyten aus der Maus entnommen haben, färben Sie sie, um die gewünschten Marker zu überprüfen. Um transkriptionelle Faktoren nachzuweisen, inkubieren Sie die Zellen mit 200 Mikrolitern 2%-Paraformaldehyd bei Raumtemperatur für 20 Minuten im Dunkeln.
Führen Sie schließlich eine Durchflusszytometrie durch, um Faktoren im frühen Stadium der akuten LCMV-Infektion zu erkennen. Am dritten Tag nach der Infektion wurde eine ausgewogene Bifurkation von follikulären Helfer-T-Zellen und T-Helfer-1-Zellen unter den MIGR1 SMARTA CD4-positiven T-Zellen gefunden. Eine vorherrschende follikuläre Helfer-T-Zell-gerichtete Differenzierung und erhöhte BCL6-Expressionsniveaus wurden in MIGR1 BCL6 SMARTA CD4-positiven T-Zellen beobachtet.
